大肠杆菌中人过氧化氢酶基因克隆及表达.doc

大肠杆菌中人过氧化氢酶基因克隆及表达（石家庄以岭药业股份有限公司，河北 石家庄 050035） ?? 摘 要：在大肠杆菌中利用基因重组技术获得高效表达的人过氧化氢酶(catalase，CAT)，即利用pMAL-c2x构建了从人cDNA文库中获得的CAT编码基因融合表达载体，并进行了表达。使融合表达获得可溶性蛋白，为后续重组酶性质的研究和开发利用奠定了基础。? 关键词：大肠杆菌；人过氧化氢酶基因；融合表达；表达? 中图分类号：R378.2+1文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）03-0005-02 1 过氧化氢酶的功能与来源? 在生物体的新陈代谢中，细胞有氧呼吸所消耗的O2约10%被还原成H2O2，而其很容易被细胞中各种还原剂还原成OH-和极毒的自由基#8226;OH，它能氧化与它接触的几乎所有细胞组分，引起衰老、癌变及其它病症。? 但生物体有自己的保护机制，体内存在的过氧化氢酶(catalase，CAT)能有效地催化细胞中产生的高浓度H2O2(2H2O2→O2+2H2O)，使H2O2不至于与细胞有氧代谢中产生的超氧阴离子自由基O-2#8226;进一步生成羟自由基#8226;OH，从而防止自由基对细胞的损伤[1]。? 此外，CAT还具有一些其它的生理功能。它除了可调节体内H2O2水平外，还可充当Hb和其它含巯基蛋白质的保护剂。主要与细胞内线粒体及过氧体结合，同D-氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联，从而迅速分解细胞代谢中产生的毒性物H2O2，起到解毒与保护巯基酶、膜蛋白等作用[2]。? 商品化的过氧化氢酶主要来源于牛肝、微球菌和黑曲霉[3]，多应用于工业生产[4]。而对医药和保健来说，人源的CAT应用价值更高。本研究利用基因重组技术将人CAT基因分别构建了融合和非融合表达载体，在大肠杆菌中实现了有生物活性的表达，为其开发利用奠定了基础。? 2 人过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达? 2.1 材料? 人cDNA文库（购自PROMEGA公司）；? 菌种E.coli TB1、JM109，质粒pMAL-c2x、pBV221，抗MBP抗血清，Amylose Resin（购自NEB公司）；? TaqDNA聚合酶，限制性内切酶XbaⅠ、PstⅠ、NcoⅠ，DNA回收试剂盒，DL3000 DNA Marker，pMD19-T Vector（购自TaKaRa公司）；? Factor Ⅹa（购自BioLabs公司）；? 二抗（羊抗兔），（购自北京百灵克生物公司）。? 2.2 方法? 2.2.1 CAT基因的获得? 根据Genbank上登录的人CAT基因NM-001752，利用primer5软件在基因全长范围设计最佳引物对，正向为：5-CGCACGCTATGGCTGACAG-3’，反向为：5-TGATGAGCGGGTTACACGG-3’，以人cDNA文库为模板进行PCR。扩增后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收，克隆至pMD19-T Vector，由北京华大基因研究中心测序。2.2.2 CAT表达载体的构建? 根据阅读框架设计两对带酶切位点的引物，并以上述经测序验证的阳性质粒为模板进行PCR扩增。其中引物对1，正向为：5-GCTCTAGAATGGCTGACAGCCG-3’，反向为：5-AACTGCAGTCACAGATTTGCCTTC-3’，并分别带有XbaⅠ酶切位点、PstⅠ酶切位点。用限制性内切酶XbaⅠ、PstⅠ双切质粒pMAL-c2X及引物对1的PCR扩增产物，分别回收目的片段与线性化载体片段后，用T4DNA连接酶连接过夜，构建融合表达载体pMAL-c2x-CAT并转化至E.coli TB1。? 2.2.3 CAT基因的诱导表达? 将37℃振荡过夜的重组菌按1％量转接到含抗生素的LB液体培养基中，20℃培养6h，加入IPTG至终浓度1mmol/L诱导12h。超声破菌后，上清液用Amylose Resin进行亲和层析纯化，SDS和Western blotting（一抗：抗MBP抗血清，二抗：羊抗兔）检测MBP-CAT表达情况。? 3 结果? 3.1 CAT基因的扩增? 通过PCR扩增可以从人cDNA文库直接获得CAT基因，但由于CAT基因较长（约1.7kb），采用一般的PCR反应条件较难获得。本研究在没有改变普通Tag酶的情况下，适当延长了延伸时间，结果获得了较理想的结果。如图1A所示，当延伸时间为1min时，没有扩增产物，但延伸时间改为2min和3min后，扩增产物随延伸时间的增加而增加。将获得的扩增产物克隆到T载体后，测序结果经BLAST分析表明，获得的目的片段为人过氧化氢酶