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大肠杆菌中人过氧化氢酶基因克隆及表达
大肠杆菌中人过氧化氢酶基因克隆及表达(石家庄以岭药业股份有限公司,河北 石家庄 050035) ??
摘 要:在大肠杆菌中利用基因重组技术获得高效表达的人过氧化氢酶(catalase,CAT),即利用pMAL-c2x构建了从人cDNA文库中获得的CAT编码基因融合表达载体,并进行了表达。使融合表达获得可溶性蛋白,为后续重组酶性质的研究和开发利用奠定了基础。?
关键词:大肠杆菌;人过氧化氢酶基因;融合表达;表达?
中图分类号:R378.2+1文献标识码:A文章编号:1673-2197(2009)03-0005-02
1 过氧化氢酶的功能与来源?
在生物体的新陈代谢中,细胞有氧呼吸所消耗的O2约10%被还原成H2O2,而其很容易被细胞中各种还原剂还原成OH-和极毒的自由基#8226;OH,它能氧化与它接触的几乎所有细胞组分,引起衰老、癌变及其它病症。?
但生物体有自己的保护机制,体内存在的过氧化氢酶(catalase,CAT)能有效地催化细胞中产生的高浓度H2O2(2H2O2→O2+2H2O),使H2O2不至于与细胞有氧代谢中产生的超氧阴离子自由基O-2#8226;进一步生成羟自由基#8226;OH,从而防止自由基对细胞的损伤[1]。?
此外,CAT还具有一些其它的生理功能。它除了可调节体内H2O2水平外,还可充当Hb和其它含巯基蛋白质的保护剂。主要与细胞内线粒体及过氧体结合,同D-氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联,从而迅速分解细胞代谢中产生的毒性物H2O2,起到解毒与保护巯基酶、膜蛋白等作用[2]。?
商品化的过氧化氢酶主要来源于牛肝、微球菌和黑曲霉[3],多应用于工业生产[4]。而对医药和保健来说,人源的CAT应用价值更高。本研究利用基因重组技术将人CAT基因分别构建了融合和非融合表达载体,在大肠杆菌中实现了有生物活性的表达,为其开发利用奠定了基础。?
2 人过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达?
2.1 材料?
人cDNA文库(购自PROMEGA公司);?
菌种E.coli TB1、JM109,质粒pMAL-c2x、pBV221,抗MBP抗血清,Amylose Resin(购自NEB公司);?
TaqDNA聚合酶,限制性内切酶XbaⅠ、PstⅠ、NcoⅠ,DNA回收试剂盒,DL3000 DNA Marker,pMD19-T Vector(购自TaKaRa公司);?
Factor Ⅹa(购自BioLabs公司);?
二抗(羊抗兔),(购自北京百灵克生物公司)。?
2.2 方法?
2.2.1 CAT基因的获得?
根据Genbank上登录的人CAT基因NM-001752,利用primer5软件在基因全长范围设计最佳引物对,正向为:5-CGCACGCTATGGCTGACAG-3’,反向为:5-TGATGAGCGGGTTACACGG-3’,以人cDNA文库为模板进行PCR。扩增后的产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收,克隆至pMD19-T Vector,由北京华大基因研究中心测序。2.2.2 CAT表达载体的构建?
根据阅读框架设计两对带酶切位点的引物,并以上述经测序验证的阳性质粒为模板进行PCR扩增。其中引物对1,正向为:5-GCTCTAGAATGGCTGACAGCCG-3’,反向为:5-AACTGCAGTCACAGATTTGCCTTC-3’,并分别带有XbaⅠ酶切位点、PstⅠ酶切位点。用限制性内切酶XbaⅠ、PstⅠ双切质粒pMAL-c2X及引物对1的PCR扩增产物,分别回收目的片段与线性化载体片段后,用T4DNA连接酶连接过夜,构建融合表达载体pMAL-c2x-CAT并转化至E.coli TB1。?
2.2.3 CAT基因的诱导表达?
将37℃振荡过夜的重组菌按1%量转接到含抗生素的LB液体培养基中,20℃培养6h,加入IPTG至终浓度1mmol/L诱导12h。超声破菌后,上清液用Amylose Resin进行亲和层析纯化,SDS和Western blotting(一抗:抗MBP抗血清,二抗:羊抗兔)检测MBP-CAT表达情况。?
3 结果?
3.1 CAT基因的扩增?
通过PCR扩增可以从人cDNA文库直接获得CAT基因,但由于CAT基因较长(约1.7kb),采用一般的PCR反应条件较难获得。本研究在没有改变普通Tag酶的情况下,适当延长了延伸时间,结果获得了较理想的结果。如图1A所示,当延伸时间为1min时,没有扩增产物,但延伸时间改为2min和3min后,扩增产物随延伸时间的增加而增加。将获得的扩增产物克隆到T载体后,测序结果经BLAST分析表明,获得的目的片段为人过氧化氢酶
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