RNA干涉和其应用.pptVIP

RNA i 及其应用实例 ;2006 Nobel Prize生理学（医学奖);后基因组研究焦点：基因功能研究;概 念： RNA interference（RNAi） 与靶基因序列同源的双链RNA所诱导一种序列特异性的转录后基因沉默现象。 ;RNAi 发现历程： 1990年，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！;1995年 康奈尔大学 Guo等在对线虫C.elegans的研究中，应用正义链RNA作为对照，研究par-1基因的表达，意外的发现，正义链RNA与反义链RNA同样能够抑制目的基因的表达。 ;1998年，Andrew Fire等首次将正义链反义链RNA混合注入线虫C.elegans中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNA interference的概念。 ;RNAi机制 ;;;RISC: RNA-Induced Silencing Complex;RNAi 的生物学意义： 一种古老、保守而又及其重要的遗传学行为。生物体在长期的进化过程中对异常基因活动的监控和防御,有学者称之为“基因组水平的免疫系统”。 一种抗病毒感染机制。;与其他反基因技术的比较： 优点： 1、特异性好； 2、抑制效率高； 3、操作相对简单，实验周期短； 缺点： 1、靶点选择的不确定性； 2、核酸的不稳定性，dsRNA引入细胞的常见问题； 3、脱靶效应； 4、生物安全性（质粒，病毒等）。;RNAi 的应用： 功能基因组学 药物靶筛选和验证 细胞信号传导通路分析 基因治疗的新策略;基因治疗方面的应用;抗器官移植排斥反应 —— 细胞间粘附分子-1（ICAM-1）是重要的介导细胞粘附和T细胞激活的分子，应用与ICAM-1基因序列特异的siRNA阻断 ICAM-1 mRNA和蛋白的表达，可以明显降低大鼠同种移植心的移植物血管病的发生的程度和缺血再灌注损伤。 ; 抗病毒策略： 最早用于HIV研究，被Science评为2002年年度突破。 斯坦福医学院的研究群，把dsRNA放进小老鼠的肝细胞，dsRNA被小老鼠体內的核酸酶分解成许多siRNA。研究发现siRNA具有高度专一性，会与小老鼠体內的丙型肝炎病毒的mRNA相结合，使mRNA分解并失去转译蛋白质的功能。斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎的研究，已从体外试管实验阶段推进至体內的动物实验。且在小老鼠身上，看到丙型肝炎病毒被阻断的明显效果。 ;2004年，美国FDA批准经过修饰的第一个RNAi药物Bevasiranib 进行临床新药试验，用于治疗与年龄相关的黄斑退行性改变。 RNAi临床治疗的前景有赖于 疾病的发生发展与特定基因的关系研究 ;利用siRNA治疗疾病需要解决几个问题： （1）导入问题，使用高效载体传递siRNA； （2）和给药方式，因为RNA容易被降解，如何提高siRNA在体内的稳定性； （3）高选择性。如何靶向特定细胞而不影响其他细胞。; RNAi方法在哺乳动物细胞中的应用 得益于RNAi机制的研究，小分子干扰RNA（short interfering RNA，siRNA) 概念的引入 。 ;哺乳动物细胞中的 RNAi 现象;RNAi过程的功能单元：siRNA;RNAi方法的核心步骤——siRNA的设计： 1、从转录本（mRNA）的AUG起始密码下游75bp开始，寻找“AA”二连序列，并记下其后面的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—60%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 靶点的选择往往是试验性的。 ; 2、将候选的靶点序列和相应的基因组数据库等进行BLAST比较。 3、选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。;提供RNAi 在线技术支持的公司（网站）;siRNA制备常用的五种方法： 1、化学合成 ； 2、体外转录 ； 3、长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)； 4、siRNA表达载体在细胞中表达形成shRNAs ；