转基因产品中短片段DNA检测方法探究.pdf

摘要 转基因深加工产品以及加工废弃物种类繁多，形态复杂，是转基因安全管理的重点和 难点。经过深度加工的转基因产品，由于其DNA通常情况下已经高度降解，DNA片段往 往较短，因此检测较为困难。我国对转基因深加工产品及加工废弃物中短片段DNA的提 取和检测技术的相关研究很少，导致我国在该领域的转基因安全管理上缺乏足够的技术支 持。本研究针对深加工产品及加工废弃物中DNA高度降解的特征，试图建立短片段DNA 的提取和检测方法。 C心椰35S启动子是最常使用的转基因元件之一，广泛存在于各种商业化转基因作物 和各种用于研究的转基因载体系统中。但在不同转基因品种中Ca~Ⅳ35S启动子序列经过 了不同的修饰，因此序列差异较大，目前还没有一种通用的CaMV35S启动子检测方法能 对所有含有Ca~Ⅳ35S启动子的转基因品种进行检测。本研究通过分析不同转基因品种中 CaMV35S启动子分子特征，试图建立通用的C心Ⅳ35S启动子检测方法，为转基因产品的 筛查检测提供可靠方法。 本论文取得以下研究结果： 1、深加工产品DNA提取方法研究：以不同原材料来源的22种深加工产品为研究对象， 利用FermentasDNA提取试剂盒法、Takara DNA提取试剂盒 DNA提取试剂盒法、Promega 法等九种不同方法分别提取DNA，比较不同方法提取的DNA的浓度和纯度，并以各种作 物内标准基因及常用的转基因外源元件进行荧光定量检测。经过实验分析，改良的SDS DNA提取法最为适合深加工产品DNA的提取。在以油菜、玉米、大豆、向日葵、花生为 主要原材料的部分深加工产品中检测出了部分转基因成分。在以水稻、玉米、花生、芝麻 为主要原材料的部分深加工产品中检测出了部分其他作物成分。这表明本研究筛选出的针 对不同作物为原材料的深加工产品的DNA提取方法提取出来的DNA适合于后续的转基因 筛查检测以及深加工产品成分检测。 2、转基因产品中短片段DNA检测方法研究：针对一些高度降解的、长度只有几十个 碱基的短片段DNA，初步设计了两种短片段DNA检测方法：无探针双引物标记交互荧光 能量共振转移定量PCR方法和环介导连接酶PCR定量检测方法。本研究以无探针双引物 标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法对6种常见的内标准基因和外源基因的灵敏度及 特异性均进行了较为深入的分析，实验结果表明该方法灵敏度高、特异性良好，可广泛应 用于短片段DNA成分的检测。本研究以环介导连接酶PCR定量检测方法对常见的内标准 基因、外源基因及筛查元件进行了初步的研究探索，扩增结果表明其可应用于短片段DNA 用于不同来源、不同含量混合样品中短片段DNA的检测。为转基因深加工产品及加工废 弃物中高度降解的短片段DNA的检测提供了有用的参考。 3、CaMV 35S启动子定量检测方法研究：针对现有的Ca~Ⅳ35S启动子检测系统中一 些检测方法的引物胨针与检测靶标的不完全匹配以及存在多个扩增产物等问题。收集了不 同来源的CaMv 35S启动子序列，并进行序列比对分析，找到了增强子序列中长度在300bp 左右的保守区，设计以增强子保守区为检测靶标序列的引物探针，建立了一种通用的CaMV 35S启动子检测方法。该方法的检测特异性在30种不同转基因作物中进行了验证，其检测 下限可达到20个拷贝，定量下限可达到50个拷贝，解决了原有的CaMV35S启动子检测方 Ⅱ 法中存在的问题。 关键词：转基因检测，DNA提取，短片段DNA检测，Ca~Ⅳ35S启动子，定量PCR Ⅲ Abstract The modified and wastewhichhavethe geneticallydeep-processingproductsprocessing variety of and are the and of speciescomplegeometry