野生型及羧基端缺失突变HBx对肝癌细胞增殖的影响.pdfVIP

· 3742 · 广东医学 2015年 12月 第36卷第24期 GuangdongMedicalJournal Dec．2015，Vo1．36，No．24 野生型及羧基端缺失突变 HBx对肝癌细胞增殖的 影响 姚雪兵 ，杨林 ，朱建芸 ，麦丽 ，崇雨田 南昌大学第二附属医院感染科 (南昌330006)； 中山大学附属第三医院感染科(广州510630) 【摘要】 目的 明确氨基端或羧基端缺失突变50个氨基酸的HBx对肝癌细胞增殖的影 向及可能机制。 方法 PCR法分别扩增氨基端、羧基端缺失50个氨基酸的HBx基因片段 (HBxn、HBxc)，并定向插入绿色荧光蛋 白(GFP)真核表达载体 pEGFP—C1以构建重组体 pGFP—HBxn及 pGFP—HBxc。脂质体转染法将重组体转染 HepG2细胞，用G418筛选，荧光显微镜下观察。RT—PCR鉴定稳定表达 GFP—HBxn、GFP—HBxc融合蛋 白的 HepG2细胞系。MTF法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期，Westernblot法检测 p16的表达。结果 RT— PCR检测示 HepG2／GFP—HBxn、HepG2／GFP—HBxc细胞分别有 HBxn、HBxc的转录和表达。MTI1法检测示 HepG2／GFP—HBx、HepG2／GFP—HBxc细胞 的增殖速度 明显快于 HepG2、HepG2／GFP、HepG2／GFP—HBxn细胞 (P0．05)。流式细胞术检测示HepG2／GFP—HBx、HepG2／GFP—HBxc细胞 的G ／G 期百分 比较 HepG2、HepG2／ GFP细胞明显减少(P0．05)，而 HepG2／GFP—HBxn细胞与 HepG2、HepG2／GFP细胞比较差异无统计学意义。 Westernblots显示HepG2／GFP—HBx、HepG2／GFP—HBxc细胞的P16表达量明显低于HepG2、HepG2／GFP细胞， HepG2／GFP—HBxn细胞P16的表达水平与HepG2、HepG2／GFP细胞无明显差异。结论 HBx及羧基端缺失突变 50个氨基酸的HBx能促进肝癌细胞的增殖，其作用可能是通过抑制抑癌基 因p16表达而调控细胞周期进而促进 肝癌细胞的增殖所致 ；HBx氨基端可能是 HBx调控细胞周期及促进肝癌增殖的重要功能区域。 【关键词】 乙型肝炎病毒 ；HBx蛋白；缺失突变；p16；细胞周期 Effectsofwild—typeandmutanthepatitisBvirusXproteinwithdeletionatC—terminusoncellproliferationin hepatocellularcarcinoma． YAOXue—bing ，YANGLin，ZHUJian—yun，MAILi，CHONGYu—tian． Department ofinfectiousdiseases，theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity，Nanchang330006，China Correspondingauthor：YANGLin．E—mail：linyang1962@ 163．com 【Abstract】 Objective ToinvestigatethebiologicalfunctionofHBVXdeletionmutationinN—terminusorC— terminusanditsrolesincarcinogenesisofhepatocellularcarcinoma．M ethods HBV X genefragmentencodingmutant HBVXproteinwithdeletion50aminoacidresiduesatN—terminusorC—temr inus(HBxnorHBxc)wasamplifiedfrom subtypeamplificationofHBV DNA byPCR．ThepurifiedHBxnandHBxcgenefragmentswereinsertedintoGFPexpres— sionvector，pEGFP—C1，toestablishrecombinantexpressionvectorpGFP／HBxn andpGFP／HBxc．HepG2cellswere transfeetedwiththeserecombinantconstructsbylipofectaminereagent，andresistantclonesexpressingGF