应用组织块培养法对大鼠视网膜干细胞进行分离培养及鉴定.doc

　　应用组织块培养法对大鼠视网膜干细胞进行分离培养及鉴定 ：齐首楠，苏冠方,王晨光,王淑荣,穆毓 【摘要】 目的：应用组织块培养大鼠视网膜干细胞的有效性。方法:机械分离出生10d大鼠睫状体组织，剪成细小组织块，置入20μg/L 碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子及1×B27添加剂的无血清DMEM/F12培养液中培养，同时取大鼠胚胎脑组织，应用常规机械酶消化法进行神经干细胞的分离培养作为阳性对照。应用免疫荧光染色检测神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白(nestin)的表达，应用含100mL/L的胎牛血清的培养基促进其分化以确定其神经干细胞特性。结果:原代培养48h后在组织块边缘开始出现细胞团，折光性强，呈球形或者桑葚状悬浮生长。培养4～5d后，悬浮生长的细胞团数量增多，出现较大的细胞团，原代培养7d后传代，传代后细胞能重新形成细胞团。应用免疫荧光方法可检测到细胞内nestin阳性表达，且视网膜干细胞可在以血清为诱导条件下变为贴壁生长，并分化出具有神经细胞形态的细胞。其形态、增殖及可分化特性与作为阳性对照的神经干细胞相似。结论：组织块培养法对细胞损伤小，操作简便，可成功对大鼠视网膜干细胞进行分离培养。 【关键词】 组织块培养法;视网膜干细胞;分离;培养;鉴定 　　METHODS: The tissue of ciliary body of postnatal 10 days rat all bits, then cultivated DMEM/F12 medium, 20μg/L bFGF, 20μg/L EGF and 1×B27 supplement at the same time, the embryonic brain derived neural stem cells (NSC) ethod as positive control. These tmunofluorescence method, arker of neural stem cells. The characteristic of differentiation of RSC L/L FBS medium. 　　RESULTS: In the primary cultivation, cell spheres ount increased gradually in the fourth or fifth day of cultivation. The passage of the cells occurred in the seventh day of cultivation, and the cells of the next passage can also formed the sphere shape. The marker nestin munofluorescence method. The RSC became adherent of the culture dish in the induced condition , and some of the cells differentiated into cells ilar age and convenience, cell, RSC)是近年来发现的成体干细胞之一。RSC在体外培养中可自我更新和增殖，亦具有多向分化的潜能，可在一定条件下诱导分化成为神经元细胞及神经胶质细胞。RSC在体外培养、分化与移植方面的研究进展为我们最终应用这些研究成果来有效的 治疗 致盲性眼病带来了希望，因而，成功对其进行分离，体外培养及鉴定则为进一步研究其分化机制及细胞治疗、基因治疗奠定基础。图1原代干细胞(IM×100) A:视网膜干细胞;B:神经干细胞。图2Nestin免疫荧光染色阳性(IF×100) A:第2代视网膜干细胞;B:第2代神经干细胞。 　 　1材料和方法 　　1.1材料 　　孕18d EM/F12培养基、胎牛血清(Gibco公司)，B27添加剂(Invitrogen公司)，胰蛋白酶、EDTA(Sigma公司)，神经巢蛋白(nestin)兔抗大鼠多克隆抗体，FITC羊抗兔抗体(武汉博士德公司)， CO2培养箱(日本SANYO公司)，倒置相差显微镜( Olympus)，超净工作台(苏州净化设备厂)等。 　　1.2方法 　　将出生10d的EM/F12培养液的培养皿中。更换新的无菌器械，在解剖显微镜下，首先剔除眼球外组织及视神经，在角巩膜缘后3～4mm处环形剪开眼球，仔细去除晶状体、玻璃体及视网膜。取出睫状体组织放入另一无菌皿内，应用微观剪刀尽量将组织剪成碎块，加入DMEM/F12培养液吹打均匀，移入24孔板中培养，并于孔板中加入20μg/L大鼠表皮生长因子(EGF)，