抗前列腺特异抗原重链可变区单域抗体基因的构建及表达.doc

　　抗前列腺特异抗原重链可变区单域抗体基因的构建及表达 　　摘 要:目的 扩增出抗前列腺特异抗原（PSA）单克隆抗体（MAb）的重链可变区（VH）单域抗体基因，并在大肠杆菌中表达. 方法 从分泌抗PSA mAb的杂交瘤细胞系E4 B7 中提取总RNA，经RT-PCR扩增VH 单域抗体基因，将其克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中进行表达. 结果 VH 单域抗体基因全长363bp，含起始码和终止码.将其克隆到pGEX-4T-1内，转化大肠杆菌DH5α，获得高效表达，表达量占全菌总蛋白质的38%，以包涵体形式存在.经初步纯化和复性后，用谷胱甘肽（GST）亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗PSA VH 单域抗体.竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性. 结论 构建成功抗PSA的VH 单域抗体，为进一步临床应用奠定基础. 　　Keyain antibody;cloning;expression 　　Abstract:AIM To amplify the VH single domain gene of an-ti-prostate specific antigen（PSA）monoclonal antibody（mAb），and express it in E.coli.METHODS Total RNA the hybridoma cell line E4 B7 ，ain antibody gene plified by PCR，cloned into the prokaryotic fusion protein expres-sion vector pGEX-4T-1and expressed in E.coli.RESULTS The VH single domain antibody gene consisted of363bp，ed into E.coli DH5α.Clones harboring plasmid pGEX-VH produced a40kDa of fusion protein in E.coli at a level of38%of the total cellular protein.After primary pu-rification and renaturation，the fusion protein atography.The fusion protein bin and the VH single domain anti-body ain antibody ed by petitive binding in-hibition assay in vitro.CONCLUSION Anti-PSA single do-main antibody has been successfully constructed for the use in clinical studies. 　　0 引言 　　前列腺特异抗原（Prostate specific antigen）是一种灵敏度较高的前列腺癌肿瘤标志物，131 I标记抗PSA单克隆抗体用于前列腺癌放射免疫显像，有较高的灵敏度和特异性［1］ .针对鼠源性单克隆抗体对人体存在着免疫原性的问题，自20世纪80年代以来基因工程抗体的研究愈来愈受到重视，其中重链可变区（VH ）单域抗体由于只有一个功能区，保留了较好的抗原结合能力，在制备和应用上有其优点.我们应用RT-PCR方法从抗PSA单克隆抗体的杂交瘤细胞系E4 B7 中扩增出VH 单域抗体基因，在大肠杆菌中获得了高效表达，并进行亲和活性测定. 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 E.coli DH5α受体菌，本室保存.质粒pUC19和pGEX-4T-1由本校生物化学教研室白玉杰博士惠赠.小鼠杂交瘤细胞系E4 B7 由本室制备，保存并培养.人前列腺癌细胞株PC-3，由北京医科大学病理教研究室从美国引进.反转录试剂盒（Promega）;Rapid DNA Ligation Kit（Boehringer Mannheim）;AdvantageTM PCR-Pure Kit（Clon-Tech）; Plus Minipreps DNA Purification System（Promega）;各种限制性内切酶，核酸分子质量标记物，凝血酶等购自华美公司和Promega公司.PCR引物Heavy Primer1和2:Pharmacia公司产品，是噬菌体呈现系统中的混合引物.设计一对含有EcoRI-起始码和终止码-SalI的VH 引物，上游引物A为:5′-GCGAATTCATGCAGGTCCAACTGCAGGA-3′，下游引物B为:5′-GCGTCGAC