新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NFκB的表达及意义.doc

　　新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NFκB的表达及意义 【摘要】 目的 观察新生鼠窒息后缺氧缺血再灌注损伤不同时间脑组织NFκB动态变化，以探讨NFκB信号途径在新生儿窒息脑损伤中的作用。方法 出生7 d新生鼠随机分为对照组(A组)和窒息组(B组);制备新生鼠窒息模型，并于窒息后1、3、5和7 d取脑组织行石蜡切片。采用免疫组织化学方法检测窒息新生鼠脑组织NFκB p65活性表达水平，用苏木精伊红染色观察窒息后脑组织形态学变化。结果 B组脑组织NFκB的表达较A组显著增强(Plt;0.05),以5 d时升高最明显;并伴有神经细胞坏死及凋亡现象。结论 NFκB可能通过炎症反应机制介导窒息脑损伤过程。 【关键词】 NFκB;窒息;新生鼠;缺氧缺血再灌注损伤; 脑组织 　　【Abstract】 Objective To observe the activation of NFκB in hypoxia ischemia reperfusion brain injury of ne of study is to explore the effect of NFκB signal pathental base for finding clinical treatment of asphyxia,in ly divided into control group (A) and asphyxia group (B).The model of asphyxia munohistochemical method atoxylineosin staining ed to observe the histological evidence of asphyxia in the brain.Results The activity of NFκB P65 ay play an important role in brain injury ia reperfusion, brain tissue 　　脑组织中的NFκB能被许多因素激活，其中包括窒息后脑组织缺氧缺血再灌注损伤。近年来的研究发现NFκB还存在于脑血管内皮细胞、神经细胞和胶质细胞中，在调节炎症反应的基因中起关键作用，与脑缺血及再灌注损伤时的炎症机制密切相关[1]。本实验建立新生鼠窒息动物模型，旨在探讨NFκB信号途径在新生鼠窒息中的作用，为进一步治疗新生儿窒息提供新的思路。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物及分组 七日龄l的缺氧瓶(即磨口瓶，保证密闭性)中，内装0.005 kg钠石灰，待动物安静后，塞紧瓶塞,密闭30 min后，立即氧罩吸氧2 h(氧浓度50%～60%)，之后放回笼中，仍由母鼠哺乳喂养。②对照组动物模型：模拟上述过程不塞紧瓶塞，仍由母鼠哺乳喂养。 　　1.3 方法 　　1.3.1 标本采集：分别于窒息后1、3、5和7d迅速横断各组新生鼠脊髓，在冰盘上快速取全脑组织，以冰生理盐水清洗至无血迹，切取含有海马组织的脑片，所有标本均经10%的中性福尔马林固定，经58～60℃石蜡包埋后，连续切片2张，厚度为4 μm，烤片30 min，供免疫组化和病理检查用。 　　1.3.2 新生鼠脑组织NFκB p65蛋白活性检测：采用免疫组化法，标本测定一次完成。测定步骤：①组织切片;②3%H2O2去离子水孵育;③蒸馏水冲洗;④80%火力微波修复;⑤PBS洗3次;⑥滴加正常山羊血清封闭液;⑦滴加适当稀释的一抗;⑧PBS振洗3次;⑨滴加生物素化二抗工作液;⑩PBS振洗3次;滴加三抗SA/HRP;PBS振洗3次;DAB显色;苏木素复染细胞核;梯度酒精脱水，中性树胶封片。免疫组化同时加作阴性对照片(PBS代替一抗)。 　　1.3.3 脑组织形态学检查:苏木精伊红(HE)染色用于观察脑组织形态学改变，脑细胞损伤情况，帮助判断坏死和凋亡细胞。 　　1.4 统计学处理 所得数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理，进行多因素方差分析，两组间比较用t检验，Plt;0.05差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 NFκB p65结果判断 阳性细胞为细胞核染成棕黄色或有棕黄色颗粒沉积，定位于细胞核和细胞浆。由二位病理医生按双盲法对免疫组化结果进行评估，即在高倍镜下(×200)随机观察10个视野,计数1 000个细胞中的阳性细胞数，计算出阳性细胞百分率，免疫组化染色图片见图1、2。 　　2.2 脑组织病理学判断 参照图谱[1]，①正常神经细胞结构：锥体细胞呈椭圆型，核染色质疏松，核仁清楚;②神经细胞损伤：胞体缩小，呈三角形或长条形，胞核固缩深染，核仁消失，细胞与周围间隙增宽。 　　2.3 神经症状