携带增强绿色荧光蛋白基因的人14—3—3σ真核表达载体的构建及其在转染乳腺癌MCF-7细胞的表达.pdfVIP

· 1342 · · 论 著 · 携带增强绿色荧光蛋白基因的人 14—3—3o真核表达载体的 构建及其在转染乳腺癌 MCF一7细胞的表达 郝 苗，齐凤杰 ，马 玲 【摘要】 目的 构建携带增强绿色荧光蛋白基因的人 14—3—3盯真核表达载体pEGFP—GV142一SFN并转染至 人乳腺癌MCF一7细胞 ，鉴定所表达的蛋白活性。方法 通过逆转录一聚合酶链反应从胎脑组织中获得编码 14—3—3cr 的全长eDNA，定向克隆至真核表达栽体GV142中，鉴定正确后与带有增强绿色荧光蛋白的pEGFP—N1一SFN酶切后 连接，重组携带 14—3—3仃的表达载体pEGFP—GV142一SFN。将pEGFP—GV142一SFN质粒转染至乳腺癌MCF一7细 胞，观察荧光蛋白的表达。结果 经限制性内切酶酶切分析、聚合酶链反应和 DNA序列测定证实 目的基因已插入重组 质粒，荧光显微镜下观察发现：转染24h后 ，乳腺癌 MCF一7细胞内可见增强绿色荧光蛋白表达，48h表达最稳定， 72h可见荧光蛋 白淬灭，细胞形态逐渐消失。结论 成功构建了14—3—3盯真核表达载体 pEGFP—GV142一SFN并转 染至乳腺癌MCF一7细胞，观察和检测到绿色荧光蛋白表达。 【关键词】 乳腺肿瘤；基因；绿色荧光蛋白质类 【中图分类号】R737．9 【文献标识码】A doi：10．3969／j．issn．1007—9572．2013．04．083 郝苗，齐凤杰，马玲 ．携带增强绿色荧光蛋白基 因的人 14—3—3盯真核表达载体的构建及其在转染乳腺癌 MCF一7细胞的表达 [J]．中国全科医学，2013，16(4)：1342—1345．[www．chinagp．net] ConstructionofEulmryoticExpressionVectorofHuman 14—3—3仃 ContainingEnhanced GreenFluorescenceProtein GeneandItsExpressioninTransfectionofHumna BreastCnacerCellMCF一7 HAOMiao，QIFeng—fie，MA ng．LiaoningMedicalUniversity，Jinzhou121000，China 【Abstract】 Objective Toconstructtheeukaryoticexpressionvectorofhuman14—3—3盯containingenhancedgreen fluorescenceproteingeneandtotransferitintohummanbreastcancercellMCF一7inordertoidentifyactivityofexpressionpro- tein．M ethods Thefull—lengthhuman14—3—3仃eDNA wasobtainedbyRT—PCR andwastheninsertedintoGV142vec- tor．AfteridentificationitwasconnectedwithpEGFP-—N1．．SFN containingenhancedrgeenfluorescentproteintorecombineex- pressionvectorpEGFP—GV142一SFN with14—3—3盯．ThepEGFP—GV142一SFN plasmidwastrnasfeetedtobreastcancer MCF-7toobservetheexpressionofrgeenfluorescentprotein．Results AmplifiedribosomalDNA restrictionanalysisandPCR andDNA sequencingshowedthatthetargetgenewasinsertedintotherecomb inedplasmid．Fluorescencemicroscopeshowedthat after24htransfeetion，expressionofenhnacedgreenfluorescentproteincouldbeseeninMCF一7，andtheexpressionwasthe moststableat48h．andtheproteinquenchednadcellmorphologysta