ATP 生物发光法测定啤酒酿造过程中污染微生物变化规律的研究 宋全厚.docVIP

ATP生物发光法测定啤酒酿造过程中污染微生物变化规律的研究 胡雪莲[1] 韩芳[1] 侯玉柱[2] 尹建军[2] 宋全厚[2] （[1] 四平金士百啤酒股份有限公司 136001） （[2] 中国食品发酵工业研究院国家食品质量监督检验中心 100027） 摘要：探讨了利用ATP生物发光微生物快速检测技术测定啤酒酿造过程中污染微生物数量的可行性。跟踪实验测定证明ATP法与显微镜镜检计数法测定结果有较高的一致性。同时，利用ATP荧光检测技术跟踪酿造过程中微生物的变化情况，结合显微镜镜检方法以全新的角度探索微生物的变化规律，为啤酒酿造过程中污染微生物的控制提供了检测方法和依据。 关键词：ATP生物发光技术 镜检 酿造过程 污染微生物 1、前言 ATP(adenosine triphosphate，三磷酸腺甙)作为代谢作用的能量载体，存在于所有的动物、植物和微生物的活体细胞中[1]。由于其在细胞中的重要地位决定其在同类细胞内的含量基本恒定，任何细胞内能量转换的变化都将由ATP水平变化来体现，从而通过评估ATP水平就能够推算出样品中活细胞数量。ATP生物发光微生物快速检测技术是一种以生物发光反应为基础的快速检测技术[2]，具体反应式如下： 荧光素酶 ATP + D-荧光素 + O2 ------------------ AMP + Oxy-荧光素+ CO2 + PPi + 光 Mg2+ 其中光强单位用RLU表示。实验结果表明，ATP发光值与被检样品中细菌总数之间存在着明显的线性相关性，因此通过被检样品中ATP发光值可判定此样品的微生物污染状况。该方法具有测定速度快、操作简便、灵敏度高等优点。据文献报道，每个特定细胞的ATP含量大致是一定的，如大肠杆菌是1.4×10-18mol/细胞，乳酸菌1.9×10-18mol/细胞，而酵母菌中ATP的含量通常是细菌中ATP含量的100倍左右[3-4]。 2、材料和方法 2.1、实验仪器 ATP荧光检测仪及配套比色杯、荧光酶制剂、无菌200μL移液枪头、一次性无粉手套、显微镜镜（OLMPUS BX41型）、血球计数板。 2、样品准备 2.1、啤酒酿造过程中取样点的确定 按照啤酒酿造工艺过程，从糖化、发酵、烛机过滤到终产品，选取18个取样点进行ATP及镜检跟踪检测，分别为糊化醪液、糖化醪液、合醪醪液、头道麦汁、煮沸开始麦汁、酒花、煮沸结束麦汁、冷麦汁、24h发酵液、高泡酒、酵母泥上清液、低温发酵液、烛机出口酒、膜捕捉器出口酒、膜精滤出口酒、高稀出口酒、结束清酒、成品酒。 2.2、检测方法 打开ATP检测仪预热10分钟，用移液枪移取样品25μL，放入无菌样品杯中，加入25μL荧光素酶，反复吸吹4次混合后推入检测仪中，读取ATP检测数值。 3、结果与讨论 啤酒酿造过程中各点污染微生物的ATP生物发光检测数据和镜检数据对比如表1所示： 表1：啤酒酿造过程中各关键点ATP荧光值(RLU)和镜检数据（个/ml）对比 序号 检测点 镜检 （个/ml） ATP值（ RLU） 1 糊化醪液 未检出 未检出 2 糖化醪液 10，000 7，839 3 合醪醪液 未检出 1，505 4 头道麦汁 250，000 11，751 5 煮沸开始麦汁 未检出 3，200 6 酒花 1，300，000 2，509，166 7 煮沸结束麦汁 1，050，000 17，792 8 冷麦汁 1，037，000 5，152 9 24h发酵液 1，307，000 1，752，711 10 高泡酒 1，433，000 1，748，230 11 酵母泥上清液 5，630，000 5，890，695 12 低温发酵液 1，543，000 1，094，036 13 烛机出口酒 13，500 13，000 14 膜捕捉器出口酒 11，500 11，250 15 膜精滤出口酒 13，000 13，350 16 高稀出口酒 5，500 5，950 17 结束清酒 6，500 10，366 18 成品酒 5，500 7，952 表中所有数据都是15个平行样的平均值； 从以上数据可以看出，糊化醪液检测结果为未检出，主要是因为取样温度在100℃以上，高温处理可以起到杀菌作用。糖化醪液取样温度在70℃左右，样品中含有少量的微生物。合醪后检测结果低于糖化醪液，高于糊化醪液。头道麦汁的ATP值较合醪醪液有所增加，可见这期间污染微生物有一定程度的增加，可能是某些耐热细菌增殖或者是管路设备存在污染造成的ATP值增加。头道麦汁与大量的洗糟水混合稀释,以及过滤槽的过滤作用使得煮沸开始麦汁ATP检测数据明显降低。 酒花样品的检测是行业内微生物控