BMP2和FGF2对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响.docVIP

　　BMP2和FGF2对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响 ：张为西, 陈松林, 姚晓黎, 卢锡林, 周琛, 冷雁, Xingming Shi 【摘要】 目的: 观察骨形成蛋白（BMP2）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向成骨细胞分化的影响。方法: 取3~18月雄性C57BL/6J小鼠（共50只）的骨髓细胞, 分离贴壁培养后, 用免疫磁珠法纯化, 并鉴定为MSCs后, 再进行贴壁培养24 h后, 分别在成骨细胞诱导培养液中加入100 μg/L BMP2和0.5 nmol/L FGF2持续诱导7、 14、 21 d后, 进行碱性磷酸酶染色、 碱性磷酸酶活性检测, Vonkossa染色以及茜素红染色, 并用递转录荧光定量PCR法检测向成骨细胞分化的标志性基因(Runx2/cbfa1、 Alp、 collagen1、 osteocalcin)的表达情况。结果: BMP2刺激组的ALP活性以及钙化结节明显高于对照组, Runx2/cbfa1, ALP, collage1, osteocalcin的mRNA呈高表达; FGF2刺激组的ALP活性以及钙化结节也高于对照组, Runx2/cbfa1、 Alp、 collagen1、 osteocalcin的mRNA表达量也高于对照组, 但不如BMP2明显。 结论: BMP2和 FGF2在不同程度上促进体外培养的小鼠MSCs向成骨细胞方向分化。 【关键词】 小鼠; 骨髓间质干细胞; BMP2; FGF2 骨髓间充质干细胞（bone marroesenchymal stem cells, MSCs）具有自我更新和多向分化的潜能, 可向成骨细胞、 脂肪细胞、 软骨细胞、 肌肉细胞甚至神经细胞分化, 已成为骨组织工程的理想种子细胞。骨形成蛋白（bone morphogeic proteins, BMP）属于TGFβ超家族成员, 是骨组织工程中应用最广泛的信号蛋白, 其中BMP2是最重要的成骨形成调控因子。而碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast groany）; 多功能分光光度计（VICTOR3TMV, PerkinElmer）; 扫描仪（Cannon, USA Inc）; 荧光定量PCR仪（MJ Research）; OneStepTMNBT/BCIP溶液（Pierce, Rockford, IL）; TRIzol试剂（Inritrogen 公司）; Taq man 逆转录酶试剂盒和SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）; BMP2(PEPRO TECH公司); FGF2(RD公司); 硝酸银溶液（Fluka）; 其余所有化学试剂均购于美国 SigmaAldrich公司。 1.2 方法 1.2.1 小鼠MSCs的体外分离、 扩增、 纯化和鉴定 按 参考 文献 ［6］的方法进行。 1.2.2 MSCs的成骨细胞诱导培养 取体外培养扩增的第4代MSCs, 以1×104/cm2的MSCs 细胞密度种植在96孔板上培养, 共分3组, 每组3个培养孔, OS对照组: 培养第2天加入成骨细胞诱导培养液（osteogenic media, OS）诱导（DMEM, 20 mL/L胎牛血清, 5 mmol/L β甘油磷酸, 50 μmol/L 抗坏血酸）, OS+BMP2诱导组: 在OS基础上再加入100 μg/L BMP2。OS+FGF2诱导组: 在OS基础上再加入0.5 nmol/L FGF2, 持续诱导, 隔日换液。7 d后, 进行碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性测定。14 d 或21 d后对于钙沉积用von kossa 染色或/和茜素红（Alizarin Red S, ARS） 染色鉴定。同时, 以同样密度的相同的MSCs接种在6孔培养板上培养, 按上述方法分组, 诱导7 d后, 收集细胞, 提取RNA, 作逆转录荧光定量PCR 检测Runx2/cbfa1, ALP, collagen1, osteocalcin的表达量。 1.2.3 ALP染色 用无磷酸钙的PBS冲洗细胞3次后, 40 g/L多聚甲醛室温固定 30 min, 双蒸水冲洗3次后, 用 OneStepTM NBT/BCIP 溶液(PIERCE ) 染色15 min, 双蒸水冲洗3次后, 扫描仪扫描。或者使用ALP染色试剂盒（SigmaAldrich No.86）按说明书步骤操作（略）进行ALP染色。 1.2.4 ALP活性测定 细胞用PBS冲洗后, 在0.5 g/L Triton X100反复冻融3次, 细胞裂解物孵育在37℃磷酸盐底物30 min,