GPERshRNA表达载体的构建和其对血管内皮细胞增殖的影响.pdfVIP

I 摘要 摘要 目的： 30， 构建人和小鼠共用的G蛋白偶联雌激素受体(G-protein-coupledreceptor RNA，sl州A)真核表达质粒，鉴定其对人血 GPER)短发夹RNA(shorthairpin vascularendothelialcells，HⅥ!Cs)和小鼠血管内皮细胞 管内皮细胞(Human vascularendothelial (mouse 鼠血管内皮细胞增殖的影响。 方法： 设计并体外合成靶向(人和小鼠)基因GPER的特异性编码短发卡RNA (shorthair RNA，shRNA)序列的寡核苷酸，同时合成一对错义的非特异性序列作 II、HindlII酶切处理的线性 为阴性对照，退火，连接到经限制性核酸内切酶Bgl 化pSUPER质粒中，转化感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆，抽提重组质粒，进 行EcoRI、HindlII双酶切电泳及测序鉴定，构建shRNA重组质粒；培养人与小 endothelial 鼠的血管内皮细胞(vascular cells，ECs)，进而将构建的三组重组质粒用脂 质体法分别转染人和小鼠的血管内皮细胞，蛋白质印迹(Westernb100检测各组 GPER蛋白水平的表达，用M兀法检测构建重组质粒对人血管内皮细胞及小鼠 血管内皮细胞增殖的影响。 结果： GPER shRNA重组质粒经酶切及测序分析表明：目的核苷酸序列成功插入 了预计位点且序列完全一致； 转染了GPERshRNA质粒的人血管内皮细胞和小鼠血管内皮细胞，与对照 shRNA2质粒的抑制作 组相比均可下调GPER蛋白的表达(PO．05)，其中GPER 用较强，转染48h后GPER蛋白的抑制率可最高可达到84．2％； 构建的重组质粒转染人与小鼠血管内皮细胞后，可显著抑制(人与小鼠)血 管内皮细胞的增殖。 结论： 成功构建同时靶向人和小鼠GPER的RNA干扰重组载体；构建成功的重组质 粒可有效抑制人血管内皮细胞与小鼠血管内皮细胞中GPER蛋白的表达；构建的 重组质粒转染人与小鼠血管内皮细胞，可显著抑制人与小鼠血管ECs的增殖，为 II 摘要 后期的多项研究奠定基础，提供重要的工具a 关键词：G蛋白偶联雌激素受体；ILNA干扰；血管内皮细胞 III Abstract ABSTRACT o bjective： theeffectofGPERonHVECsand Toobserve MVECs proliferation，short ofhumanandmouse RNA(shI州A)eukaryoticexpressionplasmid hairpin identifieditseffectson