Si-RNA及过表达慢病毒载体转染大鼠肝星状细胞SUMo-1表达的影响.pdfVIP

摘要 摘要 fibrosis，HF)是一组非常常见的慢性肝疾病的病理学综合 肝纤维化(hepatic 征。在整个肝纤维化的发生发展过程中，肝细胞内会发现许多基因的发生异常 表达，并增加发展为肝细胞性癌的危险性。在肝纤维化的发生过程中，肝星状 stellate 细胞(hepaticcells，HSCs)的活化增殖是其中的一个重要环节。肝星状细 胞位于窦周Disse间隙内，在正常状态下，HSC主要储存和代谢维生素A，合成 与分泌少量的细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)。当HSC受刺激过度激活 时，转变成具有增生活性的、产生纤维的具收缩特性的肌成纤维细胞并表达0【 smoothmuscle 平滑肌肌动蛋白(Alpha actin，0【．SMA)合成异常增多的ECM超 过肝清除能力导致其在肝内聚集是肝纤维化形成的重要机制。有研究表明适当 内胶原增强。LPS诱导的细胞模型能够较好地模拟出肝纤维化形成过程中HSC 在数量和功能方面的主要改变，为HSC活化的研究提供了一个较为全面的细胞 模型。 基因家族有四个 小泛素相关修饰物(small modifier,SUMO) ubiquitin．1ike 家庭成员，其通过共价连接修饰靶蛋白，并参与蛋白质问的相互作用，调控细胞 内靶蛋白分布及其功能。我们研究发现随着肝纤维化程度的加深，SUMO．1的表 的增殖和活化，促进其分泌大量胶原，并减少胶原降解而导致大量胶原异常沉 积，表现出的作用是促进肝纤维化。SUMO．1可可以修饰其他生长因子，维持相 关蛋白质的稳定性，从而调控肝纤维化甚至的肝癌的发展过程。因此，我们设 计该实验进一步研究SUMOs在肝纤维化过程中的作用及其机制，为肝纤维化的 治疗提供新的思路。本实验首先利用Westernblot及定量PCR检测LPS刺激 HSC．T6模拟肝纤维化的过程中SUMO．1表达水平的变化，进一步了解SUMO．1 在肝纤维化中的作用。然后我们通过针对SUMO．1慢病毒转染LPS激活后的 HSC．T6，利用Westernblot及定量PCR证实SUMO．1的表达水平的确得到干扰 及上调，再利用流式细胞仪检测转染后各组细胞株的细胞周期及凋亡，以期阐 明SUMO．1在肝纤维化中的作用机制。 Il 摘要 第一部分不同浓度LPS刺激HSC．T6 SUMO．1的表达水平变化 目的： 探讨能模拟肝纤维化时LPS刺激大鼠肝星状细胞的最佳浓度 方法： 分别用终浓度为O，lug／ml，10ug／ml，1 24 小时后分别提取RNA及蛋白质，后利用定量PCR及western blotting检测 SUMO—l的表达水平及利用western blotting检测0【一SMA的表达水平。 结果： 定量PCR发现浓度为的10ug／ml 最高，各组差异具有统计学意义(P0．05)。Westernblot验证SUMO—l上述规律 并且与0【一SMA的表达规律一致，各组差异具有统计学意义(P0．05)。 结论： 中取到一定作用。 第二部分SUMO．1表达变化后对HSC．T6增殖的影响及其机制研 究 目的： 初步探索SUMOs在HSC．T6激活过程中的作用及其机制 方法： 载体转染HSC—T6，采用定量PCR和Westernblot方法检测转染后HSC．T6中 SUMO．1的表达变化，并利用流式细胞仪检测HSC．T6的周期及凋亡。后用Real time PCR检测SUMO．2及SUMO．3的表达水平。 结果： 人工合成的针对SUMO一1基因的siRNA慢病毒能抑制肝星状细胞中 平下调，与对照组