分离的大鼠卵泡冷冻保存及移植的初步研究.pdfVIP

‘》!．怠麓曼 分离的大鼠卵泡冷冻保存和移植的初步研究 摘要 分离的大鼠卵泡冷冻保存和移植的 初步研究 博士研究生：邢卫杰 导 师：周灿权教授 中山大学附属第一医院生殖中心 中文摘要 许多患有肿瘤、血液疾病或自身免疫性疾病的女性患者因为医学水平的提高 而获得到治愈，但其卵巢功能由于物理或化学治疗而遭到了严重损害或衰竭。因 此，卵巢功能的保护受到越来越多的重视，目前保存女性生殖能力的方法有以下 几种：使用一些相应的药物来保护卵巢、冷冻保存胚胎、冷冻保存卵子、卵巢组 织的冷冻保存与移植等。卵巢组织的冷冻保存是一种有潜力的方法，因为其中含 有大量的受冷冻影响小的始基卵泡。但是，近来很多研究表明卵巢组织的移植会 引起肿瘤的复发，特别是血液系统引起的恶性肿瘤。而从卵巢组织分离得到的卵 泡的冷冻保存与移植似乎是一种很好的避免恶性肿瘤传播的方法。Oktay等首次 报道了使用胶原酶从人卵巢组织中成功地分离得到了始基卵泡。这种方法可以得 到质量好的卵泡，这是分离卵泡培养和移植的必要条件。 目前的冷冻方法主要包括慢速冷冻和玻璃化冷冻等。慢速冷冻因为不能避免 冰晶的形成，所以限制了其应用。而玻璃化冷冻是一种快速冷冻方法。其降温、 复温速度都很快，在极短时间内无法形成冰晶，而是直接地形成“玻璃样’’的固 态，始终保持了细胞内外的水分子和离子的分布，在某种程度上可以避免细胞内 外冰晶的形成，使溶质损伤减轻。 固相表面玻璃化冷冻法是近来出现的一种新的玻璃化冷冻方法。该方法是把 需要冷冻的细胞和组织放置在较高浓度的冷冻保护剂中平衡一段时间，然后直接 ‘》￡．兰，苎2 分离的大鼠卵泡冷冻保存和移植的初步研究 摘要 放置于预冷至．150℃到．180℃的固相表面，以达到快速降温。 卵巢组织移植可以作为保存卵巢功能的一种方法，但是不可避免地会造成肿 瘤复发。为了避免肿瘤复发，移植分离卵泡可能是一种好的选择。 本实验的第一个研究目的就是：首次探索固相表面玻璃化冷冻方法与以往的 慢速冷冻方法、开放式拉长麦管玻璃化冷冻方法相比，哪一种方法更适合于分离 卵泡的冷冻保存。本实验的第二个实验目的就是：对冻融后的分离卵泡以藻酸钠 为载体建立异种移植的动物模型，观察卵泡的生长发育情况和血管生成情况，并 与传统的卵巢皮质片移植作比较，希望找到更适合卵泡生长的移植模式。 第一部分 不同的冷冻方案对分离的大鼠卵泡冷冻保存的研究 实验目的 首次探索固相表面玻璃化冷冻方法与以往的慢速冷冻方法、开放式拉长麦管 玻璃化冷冻方法相比，哪一种方法更适合于分离卵泡的冷冻保存。 实验方法 1．实验动物 卵巢组织取自清洁级雌性Spragne-Dawley(SD)大鼠，鼠龄3周。 2．分离卵泡 Liberase 使用浓度为0．04mg／mL 3分离卵泡。 Blendzyme 3．慢速冷冻及复温 将卵泡放入不同的冷冻液中浸泡后，吸入麦管中，再把麦管放入程序性冷冻 仪上，缓慢降温，最后放入液氮中保存。复温时，将卵泡依次放入不同的解冻液 中，置换出冷冻保护剂。 4．开放式拉长麦管玻璃化冷冻及复温 将卵泡放入不同的冷冻液中浸泡后，吸入开放式麦管中，然后直接把麦管放 入液氮中冷冻保存。复温时，将卵泡依次放入不同的解冻液中，置换出冷冻保护 剂。 5．固相表面玻璃化冷冻及复温 将卵泡放入不同的冷冻液中浸泡后，直接将含有卵泡的液体滴在用液氮预冷 Ⅱ 瑶!，冀．纛曼 分离的大鼠卵泡冷冻保存和移植的初步研究 摘要 后的固相表面，使之成为小球，然后把小球移入冷冻管中，放入液氮中保存。复 温时，将卵泡依次放入不同的解冻液中，置换出冷冻保护剂。 6．卵泡活性检测