导入β-半乳苷酶基因的重组腺病毒的纯化.pdfVIP

中文摘要 导入13一半乳糖苷酶基因的重组腺病毒的纯化 摘 要 目的：伴随工业、农业和交通事业的发展，高能量创伤日益增多，周 围神经损伤已成为临床上比较常见的致残性损伤，而针对周围神经损伤的 治疗一直是临床上比较棘手的问题，尽管显微外科修复技术已经十分精 湛，但长期以来难获得满意效果。随着分子生物及基因工程的发展，当今 针对基因治疗研究已成为周围神经损伤研究领域的热点课题。通过研究发 现在中枢和周围神经系统中把携带目的基因的腺病毒作为载体 或者研究的目的。 其中在介导基因转染方面腺病毒载体具有诸多优点，因此在神经示踪 研究、神经再生和神经运动系统疾病的诊治中成为应用最广泛的载体。在 神经系统内导入以腺病毒作为载体的目的基因，通过目的基因在神经系统 内的表达促进周围神经的再生，同时也对神经示踪的研究的具有重要意 义。 当下，神经修复研究领域的热点是将各种神经营养因子基因融合到复 转入到脊髓或周围神经中来对受损的神经元进行保护或者在周围神经系统 中诱导周围神经的再生过程。腺病毒载体具有较高的感染效率、广泛的宿 主范围、可以将分裂期或静息期细胞感染、巨大的基因装载量、容易提取 高浓度病毒成分、毒性低水平表达等优点。利用分子生物技术克隆乳糖操 纵子基因片段LacZ基因构建腺病毒载体，制备病毒颗粒从而为进一步研 究腺病毒载体介导的LacZ基因在周围神经损伤中的应用。 LacZ基因广泛用于基因表达调控研究中的一种基因。LacZ基因编码 乳糖的水解．Beta．gal比较稳定，用X．Gal为底物进行染色时，呈蓝色， 便于检测和观察．LacZ基因的诸多优点使它成为基因工程实验中的一个 常用标记基因，因此它被用于基因的时空表达、探测已知调控序列有效区 段的位置和作用、寻找未知序列等领域。 中文摘要 因此，利用腺病毒安全、稳定、高效以及LacZ基因特异性表达等特 点当下利用含LacZ基因的腺病毒对周围神经损伤修复进行研究已成为基 因治疗的前沿。但腺病毒可以被中和抗体迅速地清除，这是由于腺病毒载 体的免疫原性比较强，在日常工作生活中腺病毒侵入人体后会诱发机体产 生抗腺病毒中和抗体。如果接受腺病毒载体介导的基因治疗后因为中和抗 体会消灭腺病毒载体，从而导致腺病毒载体在体内的数量减少而使基因治 疗失败。为了达到持续时间长、表达效果确切等效果，本实验将已有腺病 毒通过转染至293细胞，通过在293细胞中的繁殖，从而提取出具有侵染 力的浓缩的高纯度病毒。为下一步和今后研究将LacZ基因导入AdV后在 中枢和周围神经系统内的表达来促进周围神经的再生奠定基础。 方法： l HEK293细胞的培养把冻存的细胞由．196℃的液氮中快速放入 37℃水浴中融化，放入后缓慢摇晃冻存管，使细胞外冰晶融化。 10ml培养液到离心管中，轻轻吹打成悬液，放入细胞培养瓶中。将盛有 细胞和培养液培养瓶在培养箱中培养。培养箱的环境接近人体环境，为 37℃和5％C02。当细胞生长均匀时，便可计数一定体积细胞悬液中的 细胞数。然后根据公式换算出细胞在每毫升细胞悬液中含有的量。细胞 生长到占瓶底面积的90％还需要2．3次传代培养。显微镜下观察细胞， 挑选形状饱满、生长能力强的细胞接种病毒。 进行培养。待细胞生长至60％．70％时将培养液倒去，小心加入病毒混合 液。十字形轻轻晃动培养瓶使培养液盖住细胞层。放入培养箱中培养90 来判断病毒颗粒。 3腺病毒扩增将细胞在．20℃到37。C分别放置半小时，反复三次。 用离心管离心后收集上清液冰冻存于．20℃或．80℃。取三瓶培养理想的 293细胞，倒掉里面的细胞培养液，将5ml混合液放到每个培养瓶中， 轻轻晃动混匀。放到培养箱中孵育，时间大约为90分钟。向培养瓶中加 入DMEM，继续培养，时间大约48．72小时。同样的方法从第一次被转 染的细胞中取上清后再次转染细胞。便可得到再次扩增的病毒。 中文摘要 ml 4病毒的纯化离心细胞，待细胞碎片沉淀后取上清液。5 PEG8000放入每10ml上清液中，将上清放到冰上1小时使其沉淀。以 12000