骨髓增生异常综合征基因表达谱研究和液相诊断芯片的初步建立.pdfVIP

骨髓增生异常综合征基因表达谱研究及液相诊断芯片的初步建立 中文摘要 骨髓增生异常综合征基因表达谱研究 及液相诊断芯片的初步建立 中文摘要 目的：骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome, MDS)是起源于造血干细胞 (hematopoietic stem cells, HSCs) 的克隆性髓细胞造血异常。临床上以外周血中持续一 个或几个系列的造血细胞减少，骨髓造血细胞发育异常(dysplasia)或称病态造血导致 贫血和向急性髓细胞性白血病转化的高风险为基本特征。由于MDS患者的骨髓中细 胞克隆成分呈极端异质性，各种细胞克隆的生物学表型非常复杂多样且处于不断动态 变化中，而迄今尚未建立真正意义上的MDS细胞株，因此对MDS细胞的特性以及MDS 的发病机理的研究相当困难。另外，由于病态造血累及的造血细胞系列和严重程度轻 重不一,MDS患者的骨髓细胞成分和临床表现呈现极大的异质性，依赖细胞形态、染 色体畸变和临床特征等指标来诊断MDS往往相当困难，不少病例常难以确诊或误诊， 需发展新的分子诊断指标。因此，根据MDS起源于造血干细胞和病态造血二大特征， 着重从CD34+细胞全基因组表达谱芯片上分析与造血和细胞骨架调控相关基因的差 异表达，并通过处于MDS早期阶段的MDS-RA病例验证与MDS病理生理相关的某些 “候选基因”，以深入研究MDS 的发病机理并期望找到能用于MDS诊断的新分子指 标，并将新的分子指标制成液相表达芯片以用于MDS 的鉴别诊断。研究方法：应用 Affymetrix全基因组芯片分析研究各阶段MDS(难治性贫血(RA)、难治性贫血伴环形铁 粒幼细胞增多(RAS)、难治性贫血伴原始细胞增多（RAEB ）、难治性贫血伴原始细胞 + 增多转变型(RAEBt))及正常人骨髓CD34 细胞的基因表达谱，筛选MDS 中与细胞骨架 和造血干细胞造血调控密切相关基因的差异表达，再用RQ-PCR验证这些基因在核型 正常的MDS-RA病例CD34+细胞中是否也存在差异表达，分析差异表达基因与HSCs 造血调控的内在联系。由于MDS病例难以获得足量CD34+细胞，因此再分析差异表 达基因在核型正常的MDS-RA患者单个核细胞中的表达态势。选取差异表达基因与荧 光微球偶联制成低密度液相表达阵列，收集临床病例骨髓标本，分成RA组、RAEB I 中文摘要 骨髓增生异常综合征基因表达谱研究及液相诊断芯片的初步建立 组、RAEBt组、急性髓细胞性白血病（AML ）组和对照组（包括增生性贫血、缺铁 性贫血、血小板下降、白细胞下降等），分离单个核细胞，以管家基因GAPDH为内参， 与RQ-PCR结果相比较，分析液相诊断芯片的灵敏度、特异性和重复性等指标及对 MDS 的鉴别诊断效能。结果：CD34+细胞全基因组表达谱芯片筛得九个表达发生趋 势性改变的基因，其中N-cadherin、E-cadherin和 c-myc binding protein呈下调趋势； β-catenin、Rap1GAP、c-myc promoter binding protein 、Rac1 、Rac2和Cdc42呈上调趋 势。经RQ-PCR验证，核型正常的MDS-RA病例CD34+细胞差异表达基因中，Rap1 的 关键调节分子Rap1GAP显著上调(P=0.0001)，其可促使Rap1失活；而与Rap1存在反馈 调节作用的粘附分子cadherin，包括N-cadherin和E-cadherin，表达显著下调(P=0.0011, P=0.0001) ；其下游靶分子β-catenin 的表达显著增高(P0.0001) 。β-catenin 的核内靶分 子c-myc未检测出显著的表达水平改变(P=0.6859) ，但c-myc binding protein和c-myc promoter binding protein 的表达水平分别显著下调及上调(P0.0001, P0.0001)，两者分 别促进和抑制c-myc 的表达, 推测可能存在负反馈效应，反映c-myc 活性具有上调倾