骨髓间充质干细胞向成肌细胞诱导分化和大鼠间异体移植的研究.pdfVIP

中文摘要 骨髓间充质千细胞向成肌细胞诱导分化及大鼠间异体移植 。 的研究 摘 要 目的：骨髓间充质干细胞(MSCs)具有向成肌细胞、成骨细胞、成 软骨细胞、成脂细胞及神经细胞等多种成熟细胞分化的潜能，其来源丰富， 分离、培养较为容易，在体外可多次扩增，自体移值不俘在组织配型及免 疫排斥的问题。由于MSCs具有上述优点，使其引起了广泛的关注，尤其 是组织修复方面，可将其应用于器官及组织的修复治疗中。本实验通过研 究骨髓问充质干细胞在不同条件下分离、纯化、传代、鉴定及诱导，得出 培养骨髓间充质干细胞的最佳培养条件。并进一步用5一氮杂胞苷 移值入SD大鼠膀胱肌层，观察其在膀胱肌层的存活及分布状况。 (9)BrdU转染及鉴定(10)骨髓间充质干细胞异体移植 脱颈处死6周龄SD大鼠1只，75％ 结果：(1)MSCs的分离培养 酒精浸泡5rain灭菌，取出大鼠双侧胫骨及股骨，剪去长骨两端，暴露骨 髓腔，5ml注射器反复冲洗得到单细胞：悬液，移入细胞培养瓶中。根据 MSCs与杂质细胞的贴壁时间差纯化干细胞，镜下可见细胞开始贴壁变 形，原代干细胞呈圆形、三角形、多角形，杂质细胞形态呈圆形或不贴壁。 培养48h后，显微镜下观察可见贴壁细胞数量明显增多，部分呈集落样 生长。培养4～6d后，贴壁细胞分裂增殖明显，可见较多的分裂相，随着细 胞数目增多，二维生长的干细胞群内空间趋于狭窄，故出现漩涡样，成纤 维样细胞集落。(2)MSCs的鉴定对干细胞的鉴定仍然是一个难题，目 前尚无统～的、权威的标准。目前的现状是，大多数人采用联合应用多种 抗体分离鉴定MSCs，一般采用排除法或推逆法对其进行鉴定。目前最常 中文摘要 CD54、CD73、CDl05、CDl66 34、CD45、 7孛；阴仨}标’}己物有：CDl4、CD 代培养10．14天，细胞密度逐步增加，融合成片。传代接种后的细胞分布 均匀，以梭状为主。传l、2代的MSCs形态均一，呈长梭形，杂质细胞 随传代、换液逐渐减少。培养至传P8(传八代)细胞，干细胞仍然存活，但 细胞生长缓慢，形态开始变化，折光性较差，歼始脱壁凋亡。(4)不同种 植密度对MSCs生长的影响在106／ml密度接种时MTT比色法检测 OD490值最大，活细胞数量多，细胞活性较好，较利于MSCs的生长。 在10％一-15％的胎牛血 (5)不同浓度胎牛血清对MSCs生长的影响 细胞生长曲线呈S形，增殖 膏：MSCs生长。(6)传代细胞的生长曲线 包括滞留期、对数生长期、平台期三个时期，PI(传-i-℃)细胞增殖较快， 检测OD490最高，证明10umol／L lOumol／L 见小部分细胞胞体增大、变长，13d可见部分细胞相互接触，至15d一17d 的表达诱导后的细胞4d检测，未发现细胞表达肌细胞特异抗原，诱导 40 la 及餐定 在传3代干细胞中加入含BrdUg／ml标记培养基，转染48h， 观察可见细胞生长良好，悬浮死亡细胞较少，进一步铺片以免疫组化法检 测转染情况，可见部分细胞核呈棕黄色，说明转染成功。(10)骨髓间充 质干细胞异体移植 将诱导后的于细胞用BrdU标定，手术直视下移植 入大鼠膀胱内，4周后取出大鼠膀胱，以免疫组化法检测发现，移植细胞 在活体大鼠膀胱内可继续生存且分布均匀。 结论：(1)骨髓提取培养后得到的不是单一种类细胞，骨髓间充质干 细胞只占其中-d,部分，需要人为施加影响因素，使其扩增，纯化，最终 形成以干细胞为主的细胞群落。(2)MSC