骨髓间充质干细胞向胶质瘤迁移的机制探究.pdfVIP

·中文论著摘要· 骨髓间充质干细胞向胶质瘤迁移的机制研究 目 的 恶性胶质瘤的外科治疗中困扰人们的问题是肿瘤残留、复发及转移病灶、卫 星病灶切除困难，亚临床病灶难以发现等等。因此在外科手术的基础上，针对恶 性胶质瘤的放疗、化疗及生物、基因治疗等辅助治疗的重要性已为人们所共识。 靶向治疗具有效果确切，损伤小的特点，但是合适的载体很重要，寻找合适的基 因治疗载体变得很迫切。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓中的非造血细 胞，具有多向分化潜能和定向迁移能力。可诱导分化为骨、软骨细胞、脂肪细胞、 肌腱、肌肉细胞、神经细胞等多种细胞。特别是，骨髓细胞具有向肿瘤的趋化特 性，有可能成为理想的基因治疗载体。BMSCs定向迁移的机制尚不明确。目前普 遍接受的是肿瘤细胞分泌的细胞因子和BMNCs表面表达的受体间的相互作用是促 进其趋化迁移的动力。阐明BMSC迁移的机制，有助于提高向肿瘤迁移的效率，可 以提高基因靶向治疗的效果，同时有利于解释肿瘤形成的机制。血管细胞粘附分 子一l(VCAM一1)是一类重要的细胞表面粘附分子。它参与调节白细胞向微血管内 皮的迁移及附着。研究表明VCAM一1在BMSC向心血管内皮的迁移中发挥作用。而 VCAM—l在BMSCs向胶质瘤细胞的迁移中具有何种作用目前尚无报道。前期研究发 的载体的效率。 本研究首先建立大鼠骨髓问充质干细胞的体外培养体系，并进行相关的表面 标志物鉴定。同时利用体外迁移模型探讨大鼠骨髓问充质干细胞向胶质瘤细胞条 件培养基的趋化迁移能力。在这一过程中，分析VCAM．1在骨髓问充质干细胞的 表达情况以及胶质瘤细胞对其表达的调控。然后利用特异性阻断抗体研究 VCAM．1在髓问充质干细胞向胶质瘤的迁移中的作用。然后利用不同浓度的 等信号传导通路在这一过程中的作用。 材料和方法 一、骨髓间充质干细胞的体外培养鉴定及向胶质瘤细胞条件培养 基的趋化 (一) 实验材料 1、 主要试剂： 抗体。小鼠抗大鼠CD45多克隆抗体。DAB酶底物显色试剂盒。75cm2培养瓶 3422，ComingCostar公司)。 2、 实验动物 医科大学实验动物部提供。 3、 主要仪器 二氧化碳培养箱，倒置显微镜，酶标光度仪，精密PH计，电子天平，台式 离心机及超净工作台。75cm2培养瓶。Transwel1小室。 (二) 实验方法 1、 BMSC的原代取材及全骨髓贴壁法进行培养。 2、利用免疫组化及流式细胞技术鉴定BMSCs的表面标志物CD34，CD45， CD44，CDl05及CD54，CD90及CD73。 3、培养胶质瘤细胞并制备条件培养基。 4、利用Transwel1建立骨髓间充质干细胞体外迁移模型。 二、血管细胞粘附分子一1在骨髓间充质干细胞中的表达及其对迁 移的作用 (一)实验材料 1、 主要试剂： 2 PCR 兔抗大鼠VCAM一1多兜隆抗，LY294002，TRizol，RNA Kit(AMV)vcr 3．0，罗月．明标记的山羊抗兔荧光二抗，RIPA裂解液，小鼠抗大鼠JB-actin一抗及 二抗。 2、实验动物 医科大学实验动物部提供。 (二) 实验办法 1、 免疫组织化学及免疫荧光鉴定VCAM-I在BMSCs的表达。 2、 blot测定VCAM一1表达的改变。 3、Transwell体外迁移模型评估阻断VCAM-I后BMSC迁移变化。 4、 免疫荧光、RT-PCR及western 表达的影响。 三、血小板衍生生长因子-BB对BNSC的VCA卜1的表达调控 (一)实验材料 1、主要试剂： PCRKit (AMV)ver3．0(Takara)。 2、实验动物 健康雌性SD大鼠，4—6周龄，体重60