骨髓间充质干细胞移植合并深低温冻储对大鼠同种异体气管移植的作用的实验探究.pdfVIP

·中文论著摘要· 骨髓间充质干细胞移植合并深低温冻储对大鼠同种异 体气管移植的作用的实验研究 目的 临床上经常遇到因先天性疾病、炎症、肿瘤、或其它因素引起的广泛气管病 变而需要进行节段切除和气管重建。疾病导致气管节段切除后端端吻合的安全长 度为成人1／2、小儿1／3的气管长度。超过此长度时，如何修复缺损气管是国内 外胸外科的热点和难点问题。关于气管替代物的研究有许多尝试，包括同种异体 气管、非气管的自体组织(如小肠)和人工气管假体(如金属支架)等。近年来 组织工程化气管的研究，包括支架(生物材料)和种子细胞的选择、移植物再血管化 和上皮再生等方面取得了一些进展。但是，由于气管的特殊的生理特点和功能需 要，目前仍未找到理想的组织工程化气管，因而同种异体气管仍然是临床上的首 选。对于供体气管的储存，移植后的免疫排斥反应的抑制，移植气管的上皮再生 和再血管化是临床应用前亟待解决的难题。 本博士论文的设计旨在解决以上的难题，对如何储存供体气管，降低异体气 管的免疫原性，促进移植气管的上皮再生和再血管化进行了研究。我们应用静脉 移植骨髓间充质干细胞合并深低温处理供体气管进行同种异体气管移植，探讨深 低温处理对于减轻移植后的免疫排斥反应和骨髓间充质干细胞在促进移植气管上 皮和新生血管生成中的作用，为将来的临床应用提供实验依据。 材料和方法 一、大鼠深低温同种异体气管移植动物模型的建立及冻储2wk 和6wk气管移植的比较 (一)实验材料 1、实验动物 清洁级Wistar大鼠，体重280300 g，分别作为大鼠同种异体气管移植的供体 和受体。 2、主要试剂 冷冻保护剂(DMEM培养基，胎牛血清，二甲基亚砜，蔗糖，青霉素，链霉 素，二性霉素B)，水合氯醛 3、主要仪器 超净工作台；液氮罐；手术器械；光学显微镜；电子显微镜。 (二)实验动物和分组 雌性Wistar大鼠，由中国医科大学实验动物部提供。作为气管移植供体的大 鼠14只，每只大鼠可提供2个8～10个气管环的供体气管。作为气管移植受体的 wk和6wk气管的实验组 大鼠40只，随机编号分为4组，即分别移植深低温2 and ALLO．6wk)，以及新鲜自体气管移植 (cryopreservedallograft,ALLO一2wk (fresh 鼠(N=12)均在10天内死亡。 (三)实验方法 1、预先取供体气管8～lO个气管环置入装有冷冻保护剂的冻存管中，4C冷 wk。 平衡4hr后置入．80℃24llr，取出后投入液氮中储存至2wk和6 2、受体大鼠麻醉后，切除颈段2～3个气管环，将复温后的供体气管经末端 修剪后剩余6～8个气管环，以端端吻合方式与受体大鼠的断端气管吻合，并用颈 部肌肉包裹吻合部位，建立同种异体气管移植动物模型。 3、观察指标及检测方法 (1)观察术后受体存活时间。 (2)光镜和电镜观察移植物吻合口附近气管生长和再生情况。 2 二、大鼠骨髓间充质千细胞体外培养、鉴定及标记 (一)实验材料 1、实验动物 2、主要试剂 DMEM低糖培养基，成骨诱导培养液；成脂肪诱导培养液；茜草素红；油红0； 3、主要仪器 超净工作台；二氧化碳培养箱；倒置显微镜；低温离心机。 (二)实验方法 1、贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs。 2、体外诱导方法鉴定BMSCs分化能力。 3、测定BMSCs生长曲线，评估BMSCs体外生长能力。 4、应用成脂肪和成骨诱导进行BMSC的鉴定。 5、当细胞传到3～5代时，收集离心冲洗，并用PKH．26荧光进行细胞标记。 6、观察指标及检测