骨髓间充质干细胞移植对COPD大鼠肺泡壁细胞凋亡作用的探究.pdfVIP

摘 要 研究背景：慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease ，COPD ）是 一个重要的公共卫生问题，其发病机制目前尚未完全明了，主要与炎症、蛋白酶/抗蛋白 酶失衡、氧化应激以及自主神经系统功能紊乱（如胆碱能神经受体分布异常)有关。最 近研究结果表明细胞凋亡可以导致肺泡壁的破坏，参与肺气肿的形成，在COPD 发病机 制中起重要作用。 COPD 病理损伤属于不可逆改变，临床上缺乏理想的治疗方法，因此需要寻找一种 能够修复损伤组织的有效方法。近年来，骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells ， MSCs ）成为干细胞研究的热点，它不仅具有分化功能还具有分泌功能，有研究提出骨 髓MSCs 可能对COPD 具有修复作用。 因此，本课题应用骨髓MSCs 静脉注射到木瓜蛋白酶联合钴60 处理所致的大鼠肺 气肿模型中，探讨COPD 形成的机制以及骨髓MSCs 对COPD 损伤组织修复作用的机 制，为干细胞治疗COPD 的可能提供实验依据。 研究目的： 1. 观察体外分离培养大鼠骨髓MSCs 的生物学性状。 2. 研究木瓜蛋白酶联合钴60 处理所致的肺气肿大鼠肺泡壁细胞的凋亡情况。 3. 探讨大鼠骨髓 MSCs 干预在肺气肿大鼠的肺泡壁细胞凋亡和肺气肿发展过程中 的作用。 研究方法： 1. 原代培养：无菌取8周龄雄性大鼠骨髓，经密度梯度离心后取单个核细胞层接种， 保留贴壁细胞传代，观察细胞生长情况。 2. 细胞分析：测定生长曲线，流式细胞仪测定MSCs表型和细胞周期分析；体外检 测MSCs 向成骨细胞、脂肪细胞的分化情况。 3. 动物分组：12周龄雌性大鼠随机分为4组，每组6只，分别为：正常对照组（A组）， 木瓜蛋白酶组（B组），木瓜蛋白酶和钴60处理组（C组），木瓜蛋白酶和钴60处理+骨 髓MSCs干预组（D组）。动物造模：A组：气管内注入磷酸盐缓冲液（PBS ）+尾静脉注 射PBS ；B组：气管内注入8%木瓜蛋白酶液+尾静脉注射PBS ；C组：气管内注入8%木瓜 I 蛋白酶液+钴60照射+尾静脉注射PBS ；D组：气管内注入8%木瓜蛋白酶液+钴60照射+ 尾静脉注射雄性大鼠骨髓MSCs悬液。造模时间8周。 4. 检测指标：观察肺组织病理学变化；TUNEL法检测肺泡壁细胞的凋亡指数；免疫 组化法检测肺组织Ⅱ型肺泡上皮细胞数；PCR检测位于Y染色体的Sry基因；ELISA方法 检测支气管肺泡灌洗液（BALF ）中血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor ，VEGF ）水平；Western blot法检测肺组织VEGF和血管内皮细胞生长因子受体2 （Vascular endothelial growth factor receptor 2 ，VEGFR2 ）蛋白表达。 实验结果： 1. 培养的骨髓MSCs具有体外扩增潜能和多向分化潜能。 2. B组、C组、D组大鼠均出现肺气肿改变，B组、C组、D组平均内衬间隔(MLI)、 平均肺泡面积（MAA ）和单位面积平均肺泡数（MAN ）与A组比较有显著性差异 （P0.01 ）。D组与C组相比肺气肿样改变减轻，在这两组之间肺平均内衬间隔(MLI)、 平均肺泡面积（MAA ）、单位面积平均肺泡数（MAN ）差异均有统计学意义（P0.01 ）。 3. B组、C组、D组大鼠肺泡壁细胞的细胞凋亡指数（AI ）染色阳性的细胞百分比 显著高于A组（P 0.05 ），而表面活性蛋白-C （SP-C）染色阳性的细胞百分比显著低于 A组（P 0.05 ）。D组大鼠肺泡壁AI低于C组（P 0.05 ），而SP-C染色阳性的细胞百分 比高于C组（P 0.05 ）。 4. D组大鼠肺组织中可以扩增出与正常雄性大鼠一致的DNA片段序列。 5. B组、C组、D组大鼠支气管肺泡灌洗液（BALF ）中VEGF水平、肺组织中VEGF 与VEGFR2水平显著低于A组（P 0.05 ）。D组BALF 中VEGF水平明显高于C组，而且肺 组织中VEGF与VEGFR2水平也明显高于C组（P 0.05 ）。 结论： 大鼠肺泡