人系膜细胞中TNFα促进IPlt;,3gt;R1的表达和相关信号传导通路的研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 人系膜细胞中TNFQ促进I P。R1的表达及相关信号传导 机制的研究 目 的 肝肾综合征(HRS)的主要发病机制是肾小球滤过率(GFR)明显下降。已 知肾小球系膜细胞(GMCs)收缩可引起肾小球滤过面积减少。HRS患者血中肿 少与其对缩血管物质的敏感性有着密切联系。本研究用TNFa处理原代培养的人 表达；并应用信号转导抑制剂及瞬时转染活性失活的负显性突变体质粒检测对 表达的信号通路，以期为肝肾综合征GFR下降的发生机制和防治思路提供理论依据。 材料与方法 1、材料 人肾小球系膜细胞(HMC)和人肾小球系膜细胞培养液(MCM)购至美国 sccience 兔抗人I型IP3R抗体，Chemicon p-PKCa(thr637)抗体，PKC总抗体购至Celllsingnalingtechnology公司；兔抗人 13-actin多克隆抗体，Santa 物酶标记山羊抗兔二抗，Santa forNon-RadioactiveDetection 购至Calbiochen公司；PepTagRAssay ofProtein KinaseCKit，promega公司；EIlllaIlced RT EX ReagentKit、PCR试剂盒SYBR@premix Soh，Inha in Korea．惠赠(已经大连 粒及pCDNA3．0质粒由Dr．Jae—WonUniversity 宝生物工程有限公司测序分析)。去内毒素质粒小提及中提试剂盒，天能公司；转 染试剂盒：Liprofetamin一2000，invitrogen公司。 2、方法 (1)分组： 3)PMA预处理HMC细胞模型：①TNFa处理Oh组(T0h组)、 (耋)TNFa处理24h组(T24h组)、 ③PMA+TNFa处理组(PMA+T组) 4)多种抑制剂预处理删C细胞模型1 (要)safingol处理组(Sa组)、@PPl组(PPl组)、 (重)rottlerin组(rot组)、@U73122组(U组)、 (主)D609组(D组)⑧Sa+T组、@PPI+T组、 @)rot+T组、臼U7+T组、曲D+T组。 5)多种抑制剂预处理HMC细胞模型2 6)阻断PLC，PKC Q信号通路细胞模型： (亘)D609+TNFa组(D+T组)。 7)瞬时转染细胞模型： 2 @pCDNA3．0+TNF 8)TNFRl抗体或TNFR2抗体预处理HIdE细胞模型： (2)应用Westernblot、Refl．time mRNA PCR方法检测TNFa对HMCs中IP3R1 和蛋白表达的影响。 (3)应用PMA预处理HMCs，Westernblot检测对TNFa诱导IP。Rl蛋白表达的 影响。 PCR (4)应用多种信号转导抑制剂预处理HMCs，Westernblot和Real．time 方法检测TNFa对HMCs中IP3RlmRNA和蛋白表达的影响。 (5)应用Western 的活化和(或)PKCa蛋白表达的影响。