三七复合有效成分对炎性人子宫内膜细胞NO和NOS地影响.pdfVIP

引 言 子宫异常出血是妇产科疾病中重要的常见症状之一，炎症因素所 致的子宫异常出血或出血过多临床尤为常见，如急慢性盆腔炎、子宫 内膜炎、宫内节育器或药流、人流后出血，产后出血及恶露不绝等均 与炎症有直接或较密切的关系，且多为厌氧菌、需氧菌的混合感染【1] 病情往往反复难愈，严重损害广大妇女的身心健康。现代医学对该病 的治疗有一定的副作用和局限性，且治标不治本，传统医学根据其临 床表现及相关记载，将该病归属于妇科“血证”范畴，以“化瘀止血” 立法，辨证论治，疗效显著，颇具特色。 导师多年来致力于子宫异常出血的研究，观察了益气止血法、化 瘀止血法治疗子宫异常出血的；临床作用，子宫内膜局部显微形态学和 微量元素铜、锌平衡等变化，以及子宫内膜前列腺素(PGl2)血栓素 纤溶蛋白降解物(FDP)等血管活性因子水平变化，认为血瘀为子宫 异常出血的核心病机，证实了三七治疗子宫异常出血的疗效确切，并 建立炎性子宫异常出血疾病动物模型，在动物身上进行了三七复合有 效成分影响子宫内膜止血、修复的分子机制研究，但对炎性人子宫异 常出血方面，三七复合有效成分对子宫内膜止血、修复的分子机制还 不清楚，本课题拟在前期研究的基础上建立体外人子宫内膜细胞炎症 变的角度，探讨三七复合成分对子宫内膜细胞炎症的影响。 第一部分材料和方法 1．实验材料 制后加入青霉素100u／ml，链霉素100 青生物工程材料有限公司)、胰蛋白酶(上海生工，配制成0．25％浓度后 滤除菌，分装冻存；周前解冻)；四氮唑蓝(MTT，上海生工)、二甲基亚 砜(DM—SO，上海生工)。 1．2检测试剂： 新公司，DAB一0031)。 1．3主要仪器设备： 倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂)、酶标仪(芬兰LabsystemMK3)、荧 器有限公司，SP-2000UV)。 1．4诱导剂和施加药物 压过滤除菌，置4℃过夜备用。 施加药物：三七以50％乙醇12倍量渗透过滤方法提取，乙醇提取液 回收乙醇，过大孔树脂柱，分离得到总皂甙，剩余液过离子交换柱，分离 三七氨酸，液相色谱确定比例。培养液中加以三七复方成分，三七复方成 分的干扰浓度参照临床药物血浆峰值浓度PPC，结合本实验室先期所做研 究生药三七中二种成分的比例为三七总皂甙8％：三七氨酸0．4％确定，溶 解于DMEM／F一12(含1 0t 005 药准字批号202)采用反相高效液相色谱方法制备，由 湖南中医药大学制剂实验室统一分离制备，有效成分为薯蓣皂苷元 2 验所提供。 2、实验方法 2．1．正常人子宫内膜组织细胞的原代培养及细胞类型鉴定 2．1．1标本来源： 药物，无菌条件-c舌,l取月经周期7-14d子宫腔前、后壁内膜各2条。 o一40 标本来源2：组织标本来源于良性子宫平滑肌瘤手术患者，年龄2 岁，3个月内未服用激素类药物，无菌条件下取距离瘤体lcm处的子宫内膜 及少许子宫肌层组织约59。 2．1．2细胞培养 细胞培养方法在文献“1基础上予以改进，具体如下： 入含10％胎牛血清的D皿M／F一12终止消化，静置lmin后吸取上清液于离心 以5ml培养液重悬细胞，反复吹打使得细胞分散，记数细胞数量，以台盼 蓝染色确认活细胞数量大于90％，将细胞移入细胞培养瓶，37℃72h培养。 标本来源2：以液氮保存标本，标本在30min内送至细胞培养室处理消 肌肉组织，加入含lO％胎牛血清的DNEM／F-12终止消化，静置2min后吸取 上清液于离心管中，1 淀即为细胞，以l0mL培养液重悬细胞，反复吹打使得细胞分散，记数细胞 7℃72h 数量，以台盼蓝染色确认活细胞数量大于9o％，将细胞移入培养瓶，3 培养。 显微镜下观察细胞状态，将培养上述培养72h后的两种细胞加以混合 培养，重新消化细胞记数板记数细胞数量，混合比例为1