温热诱导胃癌细胞凋亡和JNK的调控机制研究.pdf

摘要 摘要 研究背景： 胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤，严重危害人类的身心健康。我国预计每 年死于胃癌的患者达16万以上，占癌症死亡人数的23％，其死亡率仍居我国的 首位。目前胃癌仍以手术治疗为主，但胃癌的早期诊断率很低，大多数患者一 经诊断往往已是晚期而失去手术的机会。而全身化疗是晚期胃癌姑息性治疗的 主要手段，但目前胃癌的化疗尚没有理想的“金标准”，且毒副作用大。肿瘤热 疗是继手术、放射治疗、化学治疗和生物治疗之后的第5大肿瘤治疗手段。尤 其在晚期恶性肿瘤或难治性肿瘤治疗方面，其最大优点是无创或微创，可与放 化疗具有协同和增敏作用，并又能减轻放化疗的副反应。热疗在肿瘤综合治疗 中的地位及意义受到越来越多的关注。大量研究表明诱导细胞凋亡是温热杀伤 肿瘤细胞的主要机理之一，但其机制目前尚不清楚。 N．terminal C．Jun氨基末端激酶(c．Jun kinase，JNK)是机体应激的主要信号 转导通路，能被多种刺激因素激活而介导细胞的凋亡。但也有研究显示JNK有 抗细胞凋亡的作用，提示JNK信号在细胞应激反应中具有复杂性、多样性。因 此目前认为JNK促凋亡或抗凋亡活性可能与细胞类型、死亡刺激以及其它信号 通路活性有关。温热属于一种热应激，在温热应激诱导胃癌细胞凋亡中，是否 存在JNK的参与及JNK信号起何种调控作用?国内外尚无相关报道。因此， 研究JNK在温热诱导胃癌细胞凋亡中的作用及其机制，可能为胃癌的防治提供 一个新的靶点，为临床胃癌防治提供科学依据。 目的： 1．探讨JNK蛋白在胃癌组织中的表达特点及其与胃癌的临床特征的关系。 2．探讨温热对胃癌细胞凋亡的影响。 3．探讨温热对胃癌细胞生物学行为的影响。 4．探测温热后胃癌细胞的P．JNK以及细胞凋亡相关基因Puma、P53、Bcl-2、 Bax、Caspase一3等蛋白表达和烈K、Bax等mRNA表达。 摘要 表达变化及其可能的机制。 材料和方法： 1．研究材料：①临床标本：胃癌标本59例，②胃癌细胞系：MKN45、 SGC7901。 2．温热细胞模型温度选择：43℃。 3．细胞损伤的形态学改变：应用倒置显微镜观察及透射电镜观察。 4．细胞活力的检测：采用四唑蓝(MTT)比色试验。 AnnexinV／PI双染色流式细胞术和TUNEL方法。 6．细胞周期的检测：采用AnnexinV／PI双染色流式细胞术方法。 7．细胞运动迁移能力的检测：采用细胞划痕愈合实验。 8．细胞侵袭能力的检测：采用Transwell实验。 9．胃癌组织及细胞的JNK信号通路相关蛋白的检测：采用免疫组织化学 PV-9000方法及Western blotting方法。 10．胃癌细胞JNK信号通路相关基因mRNA的检测：采用逆转录聚合酶链 反应(RT-PCR)法。 法。 结果： 1．JNK在人胃癌组织中的表达： JNK在胃癌组织中均有表达，在高、中、低分化胃癌组织中，阳性率分别 分期及淋巴结转移无关(均P0．05)。 2．温热对胃癌细胞凋亡的影响： (1)倒置显微镜检测结果表明，温热0．5h、lh、2h及3h后两株胃癌细胞 于0．5h，2h细胞皱缩、变圆、漂浮明显增多，3h大部分细胞出现漂浮，但SGC7901 摘要 细胞皱缩、变圆、漂浮的比例高于MKN45细胞。 仁增多，胞核及胞质可见大小不等的空泡，1h细胞形态损伤略轻于0．5h，2h细 胞核固缩、染色体发生边集及空泡变性明显，可见多量凋亡小体。 h (3)流式细胞仪检测结果显示，温热0．5h、1h、2h和3SGC7901细胞 时间组的细胞凋亡率(PO．05)。 2h和3h细胞核内出现浓染致密的颗粒块状荧光，显示出胞核固缩、染色质高 度凝聚和碎裂，并且温热1h胞核的变化轻于O．5h，2h又明显加重。 (5)AO／EB荧光双染色结果显示，与对照组相比，温热O．5h和2h细胞凋 亡数量明显增多，且1h凋亡率低于O．5h，3h细胞凋亡减少，