河南省鸡大肠杆菌分离鉴定及耐药性检测.docVIP

河南省鸡大肠杆菌分离鉴定及耐药性检测摘 要：为了对鸡致病性大肠杆菌的流行情况及耐药性调查分析，从河南省部分地区的鸡场的典型大肠杆菌病病变的病、死鸡中采集了118份内脏病料，结合培养特性对其进行了细菌的分离和生化鉴定，结果分离到大肠杆菌99株，其中致病性大肠杆菌76株。对这76株致病性大肠杆菌进行了8种抗生素敏感性试验，发现分离的菌株对8种药物均有不同程度的耐药性，四环素抑制作用最弱，丁胺卡那霉素抑制作用最强。63.2%为高度敏感，25%中度敏感，表明该药对鸡大肠杆菌是有显著的效果；其中，诺氟沙星(55.3%)，也有良好的抑制作用。 关键词：鸡 致病性大肠杆菌 细菌 耐药性 鸡大肠杆菌是鸡最常见的病原菌之一，可引起胚胎死亡、脐炎、败血症、输卵管炎和滑膜炎、肉芽肿、卵黄性腹膜炎、眼炎等一系列病症[1]。随着集约化的程度提高，饲养规模的不断扩大，鸡大肠杆菌病的流行势头也愈加猛烈；继发感染其他疾病或混合感染，致许多传染病的发病率和死亡率明显升高，以及大量的药物，疫苗和人工费用的支出，给养鸡业造成严重的经济损失，其中大肠杆菌病已居鸡细菌性疾病之首，占33%[2]。近年来变异株出现，且极易产生的耐药性，抗菌药在临床和生产中的广泛应用，特别是不规范使用、滥用，导致了细菌的耐药性的产生和扩散。在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，需要选择对细菌比较敏感的药物来进行预防和治疗，达到有效控制疾病的目的。在生产实践中，用药敏实验对鸡致病性大肠杆菌进行耐药性检查，筛选出高敏药物，对鸡大肠杆菌的治疗具有重要意义。为此，我们从采集的多份病料中进行大肠杆菌的分离，鉴定并进行了耐药性检测和分析。 1 材料与方法 1.1材料 1.1.1病料 2006年7月至10月从河南的新郑、中牟、荥阳等部分地区的鸡场的典型大肠杆菌病病变的病、死鸡采集的病料，在河南农业大学禽病研究所进分离、鉴定、保存及耐药性检测。 1.1.2培养基 营养琼脂、伊红美蓝琼脂、麦康凯琼脂等购自北京奥博星生物技术责任有限公司（060527），按照说明书要求配制；柠檬酸盐、三糖铁（TSI）等培养基按文献[3]配制。葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、乳糖微量生化鉴定管由上海市医学化验所制剂厂生产（051219）。 1.1.3试剂 革兰氏染色液、V-P、M-R、吲哚等试剂按照文献[3]配制。 1.1.4试验动物 1周龄健康雏鸡由河南农大孵化厂提供。 1.1.5药敏试验纸片氯霉素（30micro;g/片）、链霉素（10micro;g/片）、红霉素（15micro;g/片）、四环素（30micro;g/片）、庆大霉素（10micro;g/片）、诺氟沙星（10micro;g/片）、卡那霉素（30micro;g/片）、丁胺卡那霉素（30micro;g/片）购于北京天坛药物生物技术开发公司（060811）。 1.2方法 1.2.1形态观察 将采集（心、肝）病料直接涂片，革兰氏染色镜检。 1.2.2病原菌的分离培养 采用无菌操作取病鸡的心脏、肝脏，用灭菌的接种环，将病料接种于营养琼脂上，37°C，培养18~24h，选取可疑菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检并分离培养。取可疑菌落划线接种于麦康凯培养基，37°C，培养18~24h；挑取麦康凯培养基上的单个典型接种于伊红美蓝培养基上，37°C，培养18~24h；挑取在伊红美蓝培养基上的暗紫红色或紫黑色具有金属光泽的单个菌落，接种到营养肉汤进行增菌纯培养，4°C保存备用。 1.2.3生化鉴定 按常规方法进行三糖铁（TSI）实验、糖发酵、吲哚、MR和VP等生化发酵实验。并用标准菌株作参照，对其进行生化鉴定。 1.2.4致病性试验 所有易感鸡均由河南农大种鸡厂提供，按照文献报道方法[4，5]进行，以每个受试菌株的LB肉汤培养物（每ml约含107CFU）离心后，气管接种1周龄易感鸡，每羽0.2ml；另设一组为对照（6羽），每只注射0.2ml的LB肉汤，每天上、下午各观察一次记录鸡的死亡数、病变，并以心血作细菌的分离及鉴定，观察期为7d，7d后对仍然存活的鸡进行扑杀，观察病变并做细菌的分离鉴定。根据鸡的死亡数和病变程度确定分离株的致病性，标准如下：（1）高致病株：50%以上的鸡死亡或产生严重的病变（心包炎、肝周炎、气囊炎，肝坏死等）；（2）中等致病株：接种鸡不死亡，产生严重病变者不超过50%；（3）低致病性分离株，接种鸡不死亡，仅在气囊上偶尔产生病变。 1.2.5药敏试验 （见表1）按照WHO推荐的Kirby-bauer琼脂扩散法操作根据抑菌环的大小，判定10种药敏纸片对各个菌的抑菌效果。 表1 药敏纸片的种类及判定标准 药物 每片 含药量 判定标准――直径（mm） 耐