成年大鼠骨骼肌成肌细胞原代培养.doc

成年大鼠骨骼肌成肌细胞原代培养 　【摘要】 目的 探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养方法。方法　取成年Wistar大鼠的后肢肌肉,利用组织块法培养成肌细胞。并对培养细胞进行形态学研究和细胞鉴定。结果　采用组织块培养成肌细胞的密度可达118/ml, 成肌细胞的分化鉴定显示94%以上的细胞呈骨骼肌特异的肌细胞。结论　利用组织块法成功培养成年大鼠原代骨骼肌成肌细胞,该方法实用性强,所得成肌细胞纯度高,为深入研究心力衰竭骨骼肌成肌细胞自体移植奠定了基础。 【关键词】 骨骼肌成肌细胞 原代培养 大鼠 成年 【Abstract】 Objective： To explorean experimental method for primary culture of adult rat skeletalmuscle sarcoblast Methods: Muscle of posterior limb from wistar rat were cultured by tissue culture method. The cells were counted and observed by light microscopy combined with identification. Results:The number of skeletalmuscle sarcoblast 118per millilitre. skeletalmuscle sarcoblast cell differentiation accredit showed that over 94% cells were stained positive for myogenin.Conclusions:　Tissue culture method conveniently permits the purification and Proliferation of myoblast. These esults provide the basis for future studies to assess the ability of the cells to repair heart failure. 【Key words】skeletalmuscle sarcoblast primaryculture rat adult 心肌细胞是终末化组织，不能再生。心梗后坏死的心肌必然被纤维组织代替。当前内外科的治疗均不能修复及逆转已经坏死的心肌，坏死的部分经过心脏重构，最终发展为缺血性心力衰竭，其5年生存率不到50％，缺血性心衰的病理生理有多种因素参与，但丧失心肌细胞是主要原因。如何攻克缺血性心力衰竭已成为本世纪的最大课题。目前治疗终末期心力衰竭的唯一有效方法是心脏移植，而心脏移植受到器官来源、经费、免疫排斥反应方面的限制，能够接受心脏移植手术的病人目前每年只能达到近百例，目前细胞移植已经成为治疗缺血性心衰最有前景的方法之一。心肌细胞移植是向心肌梗死疤痕区注入某些肌源性未成熟或未分化的细胞成分，这些细胞在心肌的微环境下能够成熟，向心肌细胞转化，改善心功能。骨骼肌成肌细胞是首先应用于临床试验、并在临床试验中研究最多的移植细胞。越来越多的证据表明，相比较间质干细胞而言，骨骼肌成肌细胞可能是更为理想的干细胞移植对象，其原因有以下几点：①骨骼肌成肌细胞对缺血、缺氧的环境更为耐受；②骨骼肌成肌细胞可以确定的转化成横纹肌特性的肌细胞；③骨骼肌成肌细胞容易提取、分立、培养和增殖[1,2]。 1 材料与方法 选用成年Wistar大鼠购于哈医大实验中心，低糖DMEM培养基、ham，sF-10培养液、低糖DMEM培养基、小牛血清gaba公司产品骨骼肌成肌细胞获取、分离、培养及标记 选用成年Wistar大鼠,麻醉下切取胫前肌1g,研磨肌肉组织,酶解15分钟(胶原酶IA，1.5mg/ml,37’C)，继之放PBS—EDTA(0.25％)中37℃下20分钟，置入100一um细胞过滤器中，过滤后离心,细胞置于F-10培养液中,1％青链霉素(10000单位/ml)，放入细胞培养箱中培养(37℃,5％co2)。3d换液一次,待细胞长满瓶底即可传代。 2 结果 成肌细胞的培养　采用组织块培养法贴块2d后即可见有细胞从肌小粒边缘爬出,细胞呈梭形,胞浆透明。1周后细胞可长满瓶底的60%～70%,其数目可达105,此时细胞可呈多角形,充分伸展,部分细胞密集区可见细胞呈向心性生长,相互间排列整 齐,类似骨骼肌的纵切面。 成肌细胞的分化鉴定　换用诱导分化液后细胞可在3d内分化,融合交织形成肌纤维,可观察到收缩现象;并且部分细胞分化形成细长的肌管,高倍镜下可见多个核及核分裂象。这些现象为成肌细胞所特有,可以作为简便的鉴定