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糖心康对糖尿病大鼠心肌组织基因Slc4a1mRNA表达影响 　 作者：姜德友 刘春红 白玉宾 柳成刚 刘征 姚丽 周雪明 王冬 张琳 【摘要】 目的比较糖尿病性心肌病大鼠和中药复方糖心康治疗组大鼠心肌组织中基因表达的差异，并用Eve green实时荧光RT-PCR技术定量检测溶质载体家族4阴离子交换体成员（Slc4a1mRNA）在各组大鼠心肌组织的表达水平。方法差异表达基因的筛选；荧光定量RT-PCR的检测。结果糖尿病性心肌病模型组心肌组织基因Slc4a1mRNA表达下调，中药复方糖心康治疗组心肌组织基因Slc4a1mRNA表达上调。结论Slc4a1mRNA在糖尿病状态下心肌组织也有表达，并且表达下调，而中药复方糖心康可使其上调，这也是中药复方糖心康对糖尿病性心肌组织损伤具有保护作用的机制之一。 【关键词】 糖心康 糖尿病 心肌损伤 溶质 　载体家族4阴离子交换体成员糖尿病心肌损伤系糖尿病（DM）常见慢性并发症之一，其病变可以是原发的，也可继发于冠状动脉供血障碍，且心肌病变出现较早，主要表现为心肌舒张和收缩功能障碍，易发生充血性心力衰竭。其确切的病理机制尚未彻底阐明，临床尚无特效药物，而中医药在防治该病方面很有潜力，但因其病理机制复杂，其状态的描述和中药复方多成分、多环节、多靶点的作用机制，又是传统单因素研究理论与方法难以解决的，为此借助分子生物学研究方法，采用基因芯片技术，利用目前国际学术界公认的Affymetrix 公司生产的Rat 2302.0 基因芯片，寻找糖尿病心肌病相关基因，探讨糖尿病心肌病分子生物学机制, 阐释中药复方糖心康治疗糖尿病心肌病的作用机理，对STZ诱导DM大鼠的心脏基因表达谱进行了研究，并对筛选出的差异表达基因用Eve green实时荧光RT-PCR技术检测其在大鼠心脏组织中的含量及表达水平。本文仅报告糖心康对糖尿病心肌病大鼠心肌组织基因Slc4a1 mRNA表达的影响。 1 材料 1.1 试剂和药品链脲佐菌素（STZ，CALBIOCHEM，USA）；糖心康为黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制作；Rat 2302.0 基因芯片（AFFYMETRIX，USA）。 1.2 动物造模及分组Wistar大鼠，雄性，体重200～230 g，除空白对照组外，余者以25 mg·kg-1 STZ左下腹腔注射，造模成功后，再随机分为模型组和治疗组。各组均喂以高热量饲料。 2 方法与结果 2.1 给药方法治疗组以中药糖心康灌胃，空白组及模型组以生理盐水灌胃。 2.2 标本采集快速用180 ℃、12 h处理过的手术剪刀摘取心脏，立即用预冷的生理盐水冲洗，冲洗后在冰上操作，沿心室长轴切取心肌，置于液氮中冻存，以备提取RNA使用。 2.3 心肌组织差异表达基因的筛选 2.3.1 总RNA提取从各组大鼠中取心脏, 使用QIAGEN’s RNAeasy Total RNA Isolation Kit抽提总RNA，由纯化的总RNA合成双链cDNA，经PLG提取、乙醇沉淀将双链cDNA纯化，用BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit方法以生物素标记cRNA合成，QIAGEN Rneasy Columns法体外转录纯化生物素标记的cRNA，用分光光度计分析RNA浓度进行质控，凝胶电泳检测IVT产物，片断化cRNA，合成cRNA 探针。 2.3.2 基因芯片的杂交、洗脱、染色及检测合成好的cRNA探针经片段化处理后用于与基因芯片杂交。基因芯片为Affymetrix　Rat 2302.0基因表达谱芯片，芯片的杂交、洗脱、染色及检测利用Affymetrix公司生产的专用设备“基因芯片检测工作站”（work station）进行，操作过程均按该公司推荐的条件进行。 2.3.3 基因芯片检测数据的处理芯片扫描数据应用“Affymetrix Microarray Suite software 5.0”进行数据处理。 2.3.4 结果筛选标准说明：差异基因筛选标准为change为I或MI，ratiogt;或＝1，实验组Detection为P的为上调基因，change为D或MD，ratiolt;或＝-1，对照组Detection为P的为下调基因。 散点图X轴为对照组信号值，Y轴为实验组信号值，图中红色点为实验组和对照组该基因的Detection均为P，蓝色为两组中有一个值不是P，而黄色点为两组均为A（图1～4）。 按照比较严格的条件筛选出差异表达基因，表达差异2倍以上的基因列表，包括基因名称、GenBank号、Uni号和染色体定位。其中，BE113640: solute carrier family 4, anion exchanger, member 1，溶质载体家族