维生素C增强As2 O3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡探究.docVIP

维生素C增强As2 O3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡探究 　［摘要］目的: 探讨维生素C是否能影响三氧化二砷（As 2 O3 ）诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，以及它对细胞内端粒酶活性的影响。 方法: 用噻唑蓝（MTT）法筛选出维生素C的最佳浓度250μmol#12539;L -1 ，并用该浓度联合不同浓度的As2 O3 同时处理HeLa细胞后，用光镜、MTT法和流式细胞术研究细胞生长和凋亡的情况，用TRAP.ELISA法检测细胞内端粒酶活性的变化。 结果: 单独1μmol#12539;L -1 As2 O3 处理过的细胞生长未受到明显抑制，但联合250μmol#12539;L-1 维生素C处理细胞，则细胞生长受到抑制，且部分细胞出现凋亡形态学特征。2、5、10μmol#12539;L-1 As2 O3 联合维生素C用药组的细胞凋亡率也比单独用As 2 O 3 组明显增高，且出现凋亡的时间提早。端粒酶活性检测结果提示，联合用药组细胞内端粒酶活性均明显比单独用As2 O3 组低。 结论: 小剂量维生素C能增强As2 O 3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，并能增强As2 O3 对细胞内端粒酶活性的抑制作用。 　　［关键词］ 维生素C;三氧化二砷;HeLa细胞;细胞凋亡;端粒酶 　　维生素C是自然界广泛存在的一种抗氧化剂，但近来研究表明维生素C不仅有抗氧化作用而且表现出一定的亲氧化作用［1］ 。三氧化二砷（As 2 O3 ）是中药砒霜的主要成分，具有一定的抗肿瘤作用。最近有研究显示维生素C可增强As 2 O3 诱导白血病细胞凋亡的作用［2～4］ ，这种增强作用被认为可能与降低细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）水平和提高细胞内活性氧类（re-active oxygen species，ROS）水平有关［3，4］ ，但具体机制不十分明确。本研究小组前期的工作显示As2 O3 能诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，这一作用可能与其抑制端粒酶活性有关［5］ 。本研究旨在进一步研究维生素C对As2 O3 诱导HeLa细胞凋亡的影响，以及维生素C联合As2 O3 对宫颈癌HeLa细胞内端粒酶活性的影响。 　　 1 材料和方法 　　1.1 试剂As2 O3 （Sigma）用1mmol#12539;L-1 NaOH将其完全溶解，调pH至7.2，用灭菌双蒸水配制成10mmol#12539;L-1 溶液，4℃贮存，使用时用RPMI1640培养液稀释为工作浓度。噻唑蓝（MTT）和HEPES购自Amresco公司，RPMI1640培养基（粉剂）购自Gibco公司，维生素C购自Sig- ma公司，小牛血清购自杭州四季青公司，TRAP.ELISA试剂盒来自Roche公司，RT.PCR试剂盒来自Promega公司。 1.2 细胞培养及形态观察HeLa细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，用含10%小牛血清和100U#12539;ml-1 青霉素、100U#12539;ml -1 链霉素和HEPES的RPMI1640培养液，在37℃、体积分数为0.05的CO 2 培养箱中培养，每隔2～3d传代1次。实验选用对数生长期的细胞，用0.25%胰酶和0.02%EDTA混合消化液消化，用培养液稀释成单细胞悬液，以4000个细胞#12539;孔-1 接种于96孔板中，16～24h用以下两种方法处理:一种单加不同浓度（1、2、5、10μmol#12539;L -1 ）As 2 O 3 ，另一种250μmol#12539;L -1 维生素C加不同浓度（1、2、5、10μmol#12539;L -1 ）As2 O3 ，不加药组作为空白对照，每组6个平行孔，加药后每天用相差显微镜观察并记录用药组和对照组的细胞形态变化。 　　 1.3 MTT检测 　　1.3.1 维生素C浓度的筛选 细胞准备方法同1.2。16～24h分别按以下分组加药:2μmol#12539;L-1 As 2 O 3 组、2μmol#12539;L-1 As2 O 3 加不同浓度（62.5、125、250、500、750、1000、2000、4000μmol#12539;L -1 ）维生素C组和对照组（未加药），再在同样条件下培养48h后每孔加入20μl MTT（质量浓度为5g#12539;L -1 ，用0.01mol#12539;L -1 的PBS配制）后在同样条件下培养4h，弃去孔内液体，每孔加入150μl DMSO，振荡10min，在酶标仪（Multiskan MK3.353）上测定波长为492nm处的光吸收值（A），每组设6个平行孔，取平均值，以（实验组A值.对照组A值）×100%计算细胞存活率。实验重复3次以上。 　　1.3.2 不同浓度As2 O3 联合维生素C对细胞生长的影响细胞准备方法和药物处理方法同1.2。药