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唾液富组蛋白5表达载体构建 　【摘要】 目的 将唾液富组蛋白5 cDNA克隆至表达载体pGEX4T1。方法 EcoRⅠ+ SalⅠ双酶切克隆载体pMD19Thrp5及pGEX4T1，回收目的片段hrp5及双酶切载体pGEX4T1，将二者连接后转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选阳性菌落，PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。结果 唾液富组蛋白5的cDNA正确克隆至表达载体pGEX4T1，无突变。 结论 重组载体pGEX4T1hrp5构建成功。 【关键词】 唾液富组蛋白5 克隆 表达载体 Construction of Expression Vector of Salivary Histatin 5 ZHOU Qi，JIN Kehua，LUO Desheng，et al (Students of Grade 2004, Xianning University Medical School，Xianning Hubei 437100，China) ABSTRACT：Objective To clone the cDNA of salivary histatin 5 to expression vector pGEX4T1.Methods pMD19Thrp5 and pGEX4T1 were digested by SalⅠ+ EcoR.The digested hrp5 and pGEX4T1 were linked and transformed to E.coli DH5α，and the positive colonies were screened by ampicillin, and identified by PCR，digestion and sequencing. Results The cDNA of hitatin 5 was correctly inserted into expression vector pGEX4T1 without mutation. Conclusion Recombinant vector pGEX4T1hrp5 was constructed successfully. KEY WORDS:Salivavry Histatin 5；Clone；Expression vector 唾液富组蛋白5（HRP5）为富含组氨酸的阳离子多肽，存在于人类和灵长类动物腮腺唾液分泌物中。研究表明HRP5能有效杀灭耐药的白色念珠菌，且具有抗细菌、抗肿瘤及治疗关节炎的作用，作用机理独特，未发现毒副作用，不易诱导抗药菌株的产生，作为多肽类药物防治口腔等疾病潜力巨大[1]。唾液中HRP5含量低，采集唾液极为不便，提取过程繁琐，产率低；化学合成成本高；我们构建了含HRP5基因的原核表达载体，以望表达具有生物活性的HRP5。 1 材料与方法 1.1 材料 克隆载体pMD19Thrp5为前期构建[2]，原核表达载体pGEX4T1、大肠杆菌DH5α购自invitrogen公司，限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒、酶购自宝生物（大连）公司。氨苄青霉素（Amp）、琼脂糖、Yeast Extract、Tryptone、DNA Marker购自武汉凌飞科技公司，引物由上海英骏公司合成。 1.2 提取质粒pGEX4T1 将含pGEX4T1的菌株于含 Amp（100μg/ml）的固体LB培养基上划线，37℃倒置培养过夜。 选择生长良好的单菌落，接种至4ml含Amp（100μg/ml）的LB培养基，37℃ 200转/min（rpm）振荡培养12h。 取1.5 ml×2菌液，按试剂盒抽提质粒。 1.3 目的片段的酶切和回收 按文献[2]体系，酶切5份克隆载体，合并反应液，沉淀后进行2％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，按试剂盒回收。 1.4 酶切表达载体并回收 酶切体系如下： pGEX4T1 6μl 10×H Buffer 6μl EcoRⅠ 2μl SalⅠ2μl dH2O 44μl 温和混匀，37℃水浴4h；加入120μl无水乙醇，6μl 3mol/L 醋酸钠，混匀，-80℃沉淀1h；12000 rpm离心5min，弃乙醇，600μl 70％乙醇洗涤沉淀，12000 rpm离心5min，弃乙醇，室温风干，加入20μl dH2O溶解沉淀，0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，按试剂盒回收表达载体。 1.5 表达载体构建 取目的片段及酶切载体各4μl，10×ligation buffer 1μl，T4 DNA ligase 1μl，混匀，16℃连接过夜。转化DH5α感受细胞，于含Amp