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Chapter 7 蛋白质的分离、纯化和表征 一、 蛋白质的物化性质 1. 酸碱性 2. 大小和形状 3. 胶体性质 二、蛋白质的分离和纯化方法 1. 一般原则 2. 根据蛋白性质进行分离纯化的方法 三、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 一、 蛋白质的重要性质 1. 蛋白质的酸碱性 蛋白质分子中的可解离基团及其pKa值 等电点(Isoelectric point, pI) 等离子点(Isoionic point) 2. 蛋白质分子的大小与形状 测定蛋白质分子量的方法 1)根据化学组成测定最低分子量 2)渗透压测定 3)扩散系数测定 4)沉降分析法 5)凝胶过滤法 6)电泳法 2）渗透压法 In an ideal solution, ?=cRT/Mr （van’t Hoff） In a real solution, ?/c=RT/Mr + Kc 尽量采用接近等电点的缓冲液作溶剂，并增加缓冲液中无机盐的浓度。 3）扩散系数法 First law Fick diffusion: dm/dt=-DA dc/dx Second law of Fick diffusion: dc/dt = D d2c/dx2 D—diffusion coefficient, cm2.s-1 D is dependent on both the size and shape of protein and viscosity of solvent. 沉降速度法 (Sedimentation velocity) 沉降系数: s=(dx/dt)/(?2x) 沉降系数为10-13秒定义为1 S （Svedberg） Mr=RTs/D(1-??) R=8.314 J.K-1.mol-1 =0.08206 L.atm.K-1.mol-1 沉降平衡法 (Sedimentation equilibrium) 当净离心力与扩散力平衡时，离心池中形成恒定的浓度梯度 Mr=[2RT ln(c2/c1)]/[(1-??) ?2(x22-x12)] 6）电泳法 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 logMr=K1-K2?R ?R—相对迁移率 7）蛋白质分子的形状 摩擦比 f/f0=RT/(6??rND) (4 ?N/3Mr?)1/3 阿佛加德罗常数 N=6.0222 ? 1023 mol-1 f/f0 越大，蛋白质分子的不对称性越高 3. 蛋白质的胶体性质 水化层（hydration mantle）和双电层（electric double layer） 盐析(salting out) 有机溶剂沉淀 重金属盐沉淀 生物碱试剂或酸沉淀 加热变性沉淀 （一）分离纯化的一般步骤 ①原料的选择和预处理； ②组织和细胞的破碎； ③有效成分的粗提； ④精制纯化； ⑤干燥； ⑥制剂及保存。 （三）根据电荷不同的纯化方法 1. 电泳 2. 离子交换层析 常用的层析介质 聚丙烯酰胺(Polyacrylamide) 葡聚糖(Dextran)(Sephadex) G-10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200; LH-20, 60 琼脂糖(Agarose)凝胶（Sepharose） 2B, 4B, 6B: CL-2B, 4B, 6B 离子交换介质 DEAE , QAE（季胺乙基）, CM,SP（磺丙基） Sephadex, Sepharose, Cellulose 三、蛋白质分析与检测方法 凯氏定氮法：蛋白质含量=蛋白氮X6.25 （1/16%） 紫外检测：280nm（Phe257, Trp280, Tyr275) 荧光检测： Trp, Tyr 比色：茚三酮（P97）、Bradford（考马斯亮蓝G-250）, Biuret （肽键与CuSO4），Lowry（ Trp, Tyr ） 电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS，2-D SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 凝胶层析：分析蛋白质的大小 高效液相色谱（HPLC） 复习 HW: P317 No. 5, 7, 10 氨基酸、多肽、蛋白质 Chapter 3-7 （四）亲和层析 基因工程胰岛素的生产流程图 蛋白层析装置及其原理 * Molecular weight = (128-18) x Number of residual amino acids Proteins are very large molecules 1）根据化学组成测定最低相对分子量 For Example, Molecular Weight of Hemoglobin The first indicati
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