罗非鱼源无乳链球菌LuxS基因克隆与生物信息学分析_0.doc

罗非鱼源无乳链球菌LuxS基因克隆与生物信息学分析 1、相关定义 1.1、EST的定义和获得 众所周知,基因表达遵循中心法则,即要表达的基因DNA序列经转录、剪切去除内含子形成信使RNA(mRNA),mRNA再经翻译、加工合成此基因编码的蛋白质,从而行使其生理功能。而mRNA在体外经过逆转录酶、DNA合成酶等催化可以逆转录合成双链DNA,这就是基因的cDNA (complementary DNA)序列。EST是cDNA的部分序列,一个EST代表生物体某种组织某一时期的一个表达基因。EST平均长度为200-500bp,通常是从已有的cDNA文库随机挑出几百到几千个克隆,对其5或3端进行测序产生的(Adamas et al. 1991),一般使用载体多克隆位点互补序列作为通用引物来进行测序。 EST的应用 EST用于基因表达分析和新基因的发现 目前EST主要应用于寻找新基因和了解基因表达概况。一般步骤如下:建立组织或细胞的cDNA文库,从文库中随机取出足够量的以cDNA克隆进行自动测序,生物信息学分析,将所得的EST数据与dbEST等数据库的数据比较,确定哪些代表已知基因,哪些代表已知EST,哪些代表未知基因,然后进一步分析未知基因或归类分析全部EST以获得组织或细胞的基因表达概况。将测序得到的序列与GenBank数据库中已知序列进行比较,可以获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等生命过程的认识(Hatey et al. 1998)。 1994年,Swaroop等从视网膜色素上皮细胞系cDNA文库中得到了一组EST,比较分析发现其中一个EST与酵母SEC13基因有强同源性。猜测此基因功能可能与内质网中蛋白质转运有关。ODowd等利用已知的G蛋白偶联受体(GPCR)基因序列直接在dbEST中找到了四个新的同源EST,并从基因组文库中获得了全长cDNA,从而分离到了四个新的GPCR家族成员。Wilson等通过与酵母外显子核酸酶-1做同源比较,获得了一个新的人核酸酶基因家族成员-Hexl。 EST广泛用于肿瘤细胞、正常人体组织和胚胎细胞的基因表达概况研究。早在1992年,Okubo等就已经通过EST分析研究了人肝癌细胞系HepG2的基因表达概况。这是第一次系统分析肿瘤细胞基因表达的多样性和活性,从而了解与肿 瘤发生、发展的相关基因(陆佳韵等,1999)。 由于构建cDNA文库时要尽可能选用全长cDNA,所以一旦发现有价值的EST,可以找到对应的克隆,获得全长的cDNA可以直接用于转基因等研究(骆蒙等,2001)。利用EST方法发现和分离基因已经成为基因组研究的重要内容(Rounsley S et al. 1998;Sasaki T et al. 1998)。 基因组作图 在基因组的研究中,基因在染色体上的定位往往需要短序列片段的标记。这些片段被称为STS(Sequence Tagged Site)。STS是易识别的DNA序列,在同一物种的基因组中只存在于一条染色体上。由于带有物种特异的3非翻译区,3EST(即从cDNA3末端测序得到的EST)就是很好的STS(Gilpin B J et al. 1997)。EST与荧光免疫原位杂交(FISH)等技术的结合,为基因组物理图谱和遗传连锁图谱的建立提供了依据。 基因表达差异的研究 一般认为某一时期的基因表达数量通常占全部基因的15%,细胞的分化由基因特异性的时空表达决定。 近年来,对基因的差异表达研究发展了如差减杂交、mRNA差别显示等新技术,这些技术各有其优势,而EST技术的优势在于其稳定性高和分析规模大。对cDNA文库随机挑选克隆进行大规模测序,可直接回答特定组织细胞在某一时期哪些基因表达,丰度如何等问题,进而可以在基因整体水平研究相关的功能及代谢。目前基因差异表达研究是EST研究的主流,基因表达谱的研究更是其中的热点,如水稻胚乳发育中的基因表达(Liu et al. 1995)、拟南芥防御系统基因表达(Epple P et al. 1997)、油菜保卫细胞的代谢研究(Sterky et al. 1998)、杨树和松树木质形成中的基因表达(Desprez et al. 1998; Allona I et al. 1998)等。 寻找其它序列特征 如果一个物种的EST数据量比较大,基因可以覆盖全部编码基因(例如人的EST),可以从EST数据中挖掘出GC含量,密码子使用频率,简单序列重复片段(simple sequence repeats, SSR),单核苷酸多态性(SNP)等信息。总之,EST在以基因的表达和功能研究为重点的后基因组时代具有良好的应用前景。 用于制备DNA芯片 DNA芯片技术是近年来发展起来的研究功能基因组学的方法,EST是用于制备