三角褐指藻PPDK基因RNAi载体的构建和基因枪转化.pdfVIP

第 49卷 第 3期 厦门大学学报 (自然科学gt) Vo1．49 No．3 2010年 5月 JournalofXiamenUniversity(NaturalScience) May2010 三角褐指藻PPDK基 因RNAi载体的构建 和基 因枪转化 王娟飞，陈志森，陈 军 (厦门大学海洋与环境学院，福建 厦门 361005) 摘要 ：三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的全基因组序列已经公布，为了把RNAi的技术应用于三角褐指藻的 相关研究中，以C4途径关键酶丙酮酸磷酸二激酶基因(PPDK)为试验对象，构建了用于表达与 PPDK部分序列同源的 发夹 RNA(hpRNA)的载体 pPPDKi，并用基 因枪方法成功将 PPDKi和 Zeocin抗性基 因 shble共转化到三角褐指藻细 胞中．摸索出的较优基因枪转化的条件为：使用 5O 海水 f／2培养基预培养的藻进行微粒轰击，轰击压力 lO．5MPa，钨 粉直径 1．0／．tm，轰击距离 6．5am．PCR检测结果表明，在 Zeocin筛选的阳性藻株中约有 6O％同时整合了PPDKi序列． 将其中6株共转化的转基因藻与野生型藻的生长速率进行比较，发现它们的生长受到4．6 ～1O．7％的抑制．这可能是 PPDKi的表达影响了丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)的活性，从而进一步影响了三角褐指藻的生长 ，但也有可能是外源片 段的插入影响了其他基因的正常表达，导致细胞活动异常． 关键词 ：三角褐指藻；微粒轰击；RNAi；CA途径；丙酮酸磷酸二激酶 中图分类号：Q812 文献标识码 ：A 文章编号 ：0438—0479(2010)03—0400—06 海洋硅藻是单细胞光合 自养生物，对全球初级生 重新进入到叶粒体后 ，CO 进入卡尔文循环 ，丙酮酸 产力和元素循环起着重要的作用．随着硅藻基 因组信 则在丙酮酸磷酸二激酶 (PPDK)的作用下，重新形成 息的陆续公布[1屯]和转基 因方法 的建立[3]，海洋硅藻 PEP．PEP再从叶绿体进入到内质网或周质空间中，参 的生物技术利用 日益受到科学家们的重视．最近公布 与C02的固定．硅藻 C4途径的生物学意义值得深入 了全基因组序列 的三角褐指藻[2]在分类上属于硅藻 探讨 ，同时多方证据表 明硅藻 的C4途径 的生物学意 门，羽纹纲 ，褐指藻 目，褐指藻属． 义并不如陆生植物那样确定[7]．硅藻复杂的生物膜系 人们对一些高等植物如玉米、甘蔗等的 C4途径 统决定了CO。从线粒体进入到叶绿体 内需要穿越 6 已有深入的研究，在该途径中CO。的固定反应在 叶肉 层生物膜 ，这个过程要消耗很多的能量 [6]，可以将吸收 细胞的胞质溶胶中进行，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催 的光能大量消耗 ，避免细胞受到过量能量的损伤 ，从这 化 CO。连接到磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)上，形成 四碳 个角度看 ，C4途径也可能是三角褐指藻的 自我保护机 的草酰乙酸．草酰乙酸被转变成其他的四碳酸(苹果酸 制．PPDK是三角褐指藻 C4途径 的一个重要酶，催化 和天冬氨酸)后运输到维管束鞘细胞，在维管束鞘细胞 丙酮酸转变成 PEP．本文构建 了用于表达 PPDK基 中被降解成 CO。和丙酮酸，CO2在维管束鞘细胞 中进 因hpRNA 的载体 pPPDKi，并将其成功导入到三角褐 入卡尔文循环．Kroth等[6分析了三角褐指藻的碳代 指藻细胞 中，期望通过抑制此基因的表达更深入地研 谢途径 ，发现三角褐指藻具有类似于陆生植物 C4途 究海洋硅藻 C4途径的生物学意义． 径的关键酶，CO 进入细胞后在碳酸酐酶作用下首先 RNA干扰 (