血红素加氧酶-1对糖尿病血管病变影响及机制初探.pdf

中 文 摘 要 调eNOS表达水平和活性有关。 4血红素加氧酶-1基因转染对高糖和高脂培养的人脐静脉内皮细胞的保 护作用 此部分包括以下两项内容: 4.1HO-1基因转染人脐静脉内皮细胞 我们在体外建立了逆转录病毒转染体系，借助逆转录病毒载体将 HO-1基因转染入人脐静脉内皮细胞系ECV304。转染过程如下: (1)XM6/hHO-1重组体的构建:将PGEM7zf(+)/hHO-1质粒用Hind III酶切，把得到的987bp的hHO-1全长cDNA片段插入到XM6载体的 HindIII位点。用限制性内切酶ApaI消化，筛选出正向插入目的基因的重 组质粒XM6/hHO-1a (2)逆转录病毒的包装及转染内皮细胞:使用DOTAPDNA转染试剂盒 及其推荐的方法转染包装细胞系PA317，经G418(400gg/mU筛选后可 形成抗性克隆，扩大培养。以NIH3T3细胞为靶细胞测定病毒滴度和检测 体系内是否有辅助病毒的产生，将滴度大于1X1护CFU/ml细胞克隆用于 以下实验。用PA317/hHO-1细胞的上清转染ECV304细胞，经500p留ml G418筛选得到抗性克隆，扩大培养得到转染细胞，命名为ECV304/hHO-1a (3)转染细胞的鉴定:采用RTPCR,Westernblot和免疫细胞化学方法 检测ECV304/hHO-1细胞HO-1的表达。 经NIH3T3细胞检测本体系内无辅助病毒的产生，包装后病毒滴度为 4-lOXlOSCFU/mlaECV304/hHO-1细胞HO-1mRNA和蛋白表达均较未 转染细胞增高。本部分实验应用逆转录病毒载体介导的基因转染技术在体 外建立一株HO-1高表达内皮细胞系。 4.2转染血红素加氧酶-1基因对高糖和高脂诱导内皮细胞损伤的影响 本部分实验将探讨提高HO-1表达对高浓度软脂酸(palmiticacid,PA) 和葡萄糖诱导的内皮细胞损伤的影响。分组如下:① 未转染ECV304组; ②ECV304/hHO-1组;③ECV304/hHO-1+ZnPP(20pmol/L)组。将各 组细胞分别培养于含不同浓度的葡萄糖和/或PA的培养基中。培养48h 后，检测细胞存活率(MTT法)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH) 释放率、MDA含量和细胞凋亡率。结果如下: (1)细胞生存率分析:ECV304/hHO-1细胞在用含5.5mmol/LD-葡萄糖、 s 中 文 摘 要 20mmol/LD-葡萄糖或125ummol/LPA的培养基培养48h后，细胞存活率 与相同培养条件下的未转染细胞没有显著差异 (P0.05);与生理浓度对 照组相比，ECV304细胞在20mmol/LD-葡萄糖联合不同浓度PA共同培 养48h后，存活率明显下降，而ECV304/hHO-1细胞存活率较相同处理因 素的ECV304细胞均提高(P0.05);与相同培养条件下的ECV304/hHO-1 相比，在加用HO-1抑制剂ZnPP后，ECV304/hHO-1细胞的存活率有所 下降 (P0.05). (2)LDH释放率和MDA含量分析:在5.5mmol/LD-葡萄糖培养基中培 养48h后，各组细胞LDH释放率和细胞MDA含量均无显著差异。经 20mmol/LD-葡萄糖+250gmol/LPA 培养 48h后，ECV304和 ECV304/hHO-1细胞LDH释放率和细胞MDA含量与对照组相比均明显 升高，但ECV304/hHO-1细胞较ECV304细胞有所降低，两者相比有显著 差异。在相P[i培养条件下加用ZnPP,ECV304/hHO-1细胞LDH释放率和 细胞MDA含量进一步上升。 (3)细胞凋亡率分析:各组细胞培养于含5.5mmo1/LD-葡萄糖的培养基 48h后，各组fal细胞iM.亡率无差异;用20mmoi/LD-葡萄糖+250umol/LPA 培养48h后，ECV304/hHO-1十ZnPP组细胞凋亡率较ECV304/hHO-1组 和ECV304组细胞显著提高。 研究结果提示:HO-1基因的表达上调可减轻高糖和高脂对内皮细胞 的损伤，其机制与抑制细胞内氧化应激反应有关。 结 论 1.提高HO-1的表达水平可降低STZ大鼠早期的