烟草转基因检测标准及PCR反应体系的研究.pdfVIP

18 中国烟草学报 2000年9月 第6卷 第3期 烟草转基因检测标准及PCR反应体系的研究* 郭兆奎 魏继承 于艳华 万秀清 摘 要 通过对PCR体系和反应条件的优化，确定了针对35s启动子序列进行转基因检测的最佳反应体系和反应条件，利用 纯阳性模板经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳确认lng模板DNA为纯阳性样品理想扩增下限，同时以不同阳性含量的干烟 叶为材料，确定了烟叶转基因检测的标准为0．1％，建立了转基因外标定量法，并通过已知阳性含量样品的检测对该反 应体系和检测标准进行了结果验证。 关键词：转基因烟草检测 PCR体系和条件 标准 PCR扩增是进行转基因烟草检测的关键技术，而 C．PCR引物：①叶绿体不编码蛋白基因引物序 PCR反应是通过DNA体外扩增来进行的，其扩增情 列： 况不仅受其扩增目标序列DNA模板的影响，还与扩 Plant一1 5’C G A A A T C G G T A G A C G C T 增体系和扩增条件有关，在扩增体系和扩增条件不适 A C G 一3’ 宜时，即使体系中存在目标DNA，也可能不出现扩增 Plant一2 5’G G G G A T A G A G G G A C T T G 条带，在不存在目标序列时，却有可能出现非特异性条 A A C一3’ 带【1】。综合前人的研究结果，由于目标基因引物及扩 ②35s启动子序列 增片段的不同，其扩增体系和扩增条件也有很大差异， 35s一1 5’G C T C C T A C A A A T G C C A T C 退火温度一般在52～64℃，变性，退火和延伸时间也 A 一3 有很大差异 ．3】。由于烤后烟叶中目标DNA含量差 35s一2 5’G A T A G T G G G A T T G T G C G T 异较大，摸索出一个能够扩增出阳性含量跨度大、稳定 C A 一3 的PCR扩增体系对烟草转基因检测有其重要意义。 上述引物由宝生物工程(大连有限公司)合成， 本实验室经过试验研究，建立了较为稳定的PCR扩增 HPLC纯化。 体系和反应条件，能准确地检测出阳性含量为0．1％ 1．2 试验方法 的烤后烟叶样品。 1．2．1 DNA提取方法 1 材料和方法 (1)向内盛待测样品的1．5mL离心管中加入 700“L 0．75XCTAB抽提缓冲液，剧烈振荡混匀后放入 1．1试验材料 65℃的恒温水浴中10min。 A．用转烟草普通花叶病外壳蛋白基因(TMV— (2)加入700肚L氯仿：异戊醇(24：1)提取液，轻度 CP)的NC89和未转基因的NC89烤后烟叶配制成含 而充分混匀后，12000g离心5rain。 100％、10％、5％、1％、0．5％、0．1％和0．05％阳性成 (3)取上清液，加入1／10体积的10％CTAB提取 分的烟叶样品。 液，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)提取液，12000g B．Taq酶等PCR试剂为Promega产品，购于天象 离心4min。 人生物技术工程公司。