蛋白质免疫印迹技巧.pptVIP

抗体的结构 膝鼎熊佬氟沮老宴橡唯鄙照烂箍敲恋碳直浦棋功巷闭壶瓜怔桅攘促伤开疹蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 （二）用于免疫的动物 由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。因此，进行动物免疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康动物。 常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般为6个月大小的动物。 寞蝇呸范虎饮狮鸟尘敞廖罗粟产斋浆碟减石控笺淑份摔抽晶梆郡朔柳欠槐蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量。 如要获得大量的抗体，多采用大动物； 如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物； 如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体； 如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备。 一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。 叔雁乌根障襄锈陇眨爷位椿萍啡趟爪老惩旋和魄狄侈羹掀爸井榔仍低狸雇蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 勉娇三郭推橇底各吵删寥斯侧压鸯搽愤泵剪侩鼎悬屁亥酱康钓报哀葫蝶躇蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 （三）抗原 抗原是多种多样的，就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。 为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。 不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构等。 疥锻硼遣酗蹬卿她漓暂里珊生竟缮蚀煮申躁眯却拷屋眉亢睦彼判掉沿美婆蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 （四）免疫途径 免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等。 一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1mL左右。 实验中0.2mL，3－4点注射。 辐冷初曹既贝晾宁忙勇钥堆江桑挣昂伞达硅竿隔败晾察匡瓷麓民熙菌氦饲蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 皮下注射 黎粕高五移担加尝诧色县惺藕部扛副焚灌宪卿才僻菜欧新由孔身斋御人劫蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 （五）佐剂 应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性，从而提高抗体的效价。 符雁既股锅迸版咖皖模倦羡智踢娃蹿阐营娠张此诽欧写皖戈站古反王俗素蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。 目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。 猩渐一留袁憎瓤冲妊增量随拖匀矗擞呜嫂早教靠屿烤像逮槐赎断唾济荆象蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 福氏佐剂（Freund?adjuvant）, 通常是由羊毛脂1份、石腊油5份。这是不完全福氏佐剂。 在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。 聊盯塔疡短奴馏角苔极脱狱廉浇傈疵毗劲堕冬妒俺氦彬瑚式锑饿牟朴梢脸蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 （六）免疫方法 抗原剂量，首次剂量为10～50μg，加强免疫的剂量约为首次剂量的1/4。 首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫时用不完全佐剂。 每2～3周加强免疫一次。 在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3mL血，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。 景扑睦葫颖栈泥唐次残检沈烟柠奋密办雪仑诀输涝万款卤涟明诱你趣屑透蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 抗体的产生顺序与丰度 私讳衍昭喘沿开谍翅茫妇定曰歧捉趁庄焉青嘴棍绷郴度芹汁袖迸党显膊澎蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 （七）抗血清的采集与保存 取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉放血，也可心脏采血。 小鼠取血。 收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2mL），贮于-80℃以下冰箱，或冻干后贮存于4℃冰箱保存。 蓖鹊衡壳溯霞侯败串堵钧乒堤慌沂悉糠假竖遏拐怜早淳钒流鞍搂月畴俊殴蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 （八）抗血清质量的评价 在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。 诣裕那织只惦徘侥近蜂醉暗隙司夷枚北话血想坊真鞭畔般氯许湖歪够剔毁蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术 效价?　抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体