以apoai为靶点的基因表达上调剂筛选模型的建立-中国医药生物技术.pdfVIP

178 中国医药生物技术 2011 年 6 月第 6 卷第 3 期 Chin Med Biotechnol, June 2011, Vol. 6, No. 3 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.03.003 ·论著· 以Apo A-I 为靶点的基因表达上调剂 筛选模型的建立 杜郁，王丽，王丽非，司书毅，杨媛，洪斌 【摘要】 能成为动脉粥样硬化治疗的新途径。 目的 建立靶向人 Apo A-I 转录调控序列的高通量药物筛 载脂蛋白 A-I （apolipoprotein A-I，Apo A-I ） 选模型，用于筛选 Apo A-I 基因表达上调剂。 是 HDL 的主要结构蛋白和功能单位，与 HDL 的 方法 以人基因组 DNA 为模板，PCR 扩增 Apo A-I 上游 形成密切相关。Apo A-I 在血浆中的浓度与 HDL-C 的启动子序列，克隆至荧光素酶报告基因质粒 pGL4.17 上 的水平相关，可通过多种机制发挥抗动脉粥样硬化 游，采用脂质体介导的方法将重组质粒转染人肝癌细胞 作用[4]，有望成为动脉粥样硬化的治疗靶基因之一。 HepG2 ，在 G418 抗性存在的条件下，通过有限稀释法筛 通过对肝细胞中 Apo A-I 基因调控区缺失图谱和 选稳定转染细胞株。对溶剂浓度和药物作用时间进行条件 转基因鼠的研究发现，转录起点 –220 ~ –110 bp 的 优化，应用阳性化合物染料木素评价模型有效性，通过检 启动子区域存在几个重要的转录因子结合位点，包 测荧光素酶的表达活性变化来筛选人 Apo A-I 基因表达上 括 Site A （–214 ~ –192 bp ）、Site B （–169 ~ –146 bp ） 调剂。 和 Site C（–134 ~ –119 bp ），对于维持肝细胞中 Apo A-I 的正常转录和表达是必需的[5] 。本研究以上述 结果 通过 PCR 成功扩增了人 Apo A-I 基因上游的启动 Apo A-I 的启动子序列为靶点，利用报告基因体系， 子序列，构建了相应的重组荧光素酶报告基因质粒 pGL4- 建立稳定转染细胞用于基因表达上调剂的高通量 ApoP ，并建立稳定转染细胞株 ApoP-Luc HepG2 。对筛选条 件优化后，应用阳性化合物进行评价，筛选窗相关系数 Z’ 筛选。将 Apo A-I 基因上游的 –277 ~ +173 bp 片 因子为 0.68 ，大于 0.5 ，适于进行高通量筛选。应用该筛选 段克隆于荧光素酶报告基因的上游，得到受 Apo A-I 基因启动子调控的重组报告基因表达质粒，并 模型对 5000 余种化合物进行筛选，4 个黄酮类化合物和白 获得了稳定转染 HepG2 细胞的单克隆细胞株，经 藜芦醇显示出较好的活性，半数有效浓度均小于 10 μg/ml 。 筛选条件优化和评价，建立了针对人 Apo A-I 的基 结论 成功建立了人 Apo A-I 基因表达上调剂筛选模型， 因表达上调剂药物筛选模型。 并利用该模型筛选到 5 个活性化合物。 【关键词】 载脂蛋白 A-I ； 转录启动子； 荧光素酶 1 材料与方法 类； 药物评价，临床前 1.1