可视化突变建模定点突变和表达超耐热菌d-乳酸脱氢酶.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（５）：７３７８ 可视化突变建模、定点突变和表达 超耐热菌Ｄ乳酸脱氢酶 １，２，３ ２ ２ １，４ 田晋红 　刘　琦 　战丽萍 　周泽扬 （１西南大学蚕学与系统生物学研究所　重庆　４００７１６　２西南大学药学院　重庆　４００７１６） （３重庆市兽药工程技术研究中心　重庆　４００７１６　４重庆师范大学生命科学学院　重庆　４０００４７） 摘要　目的：构建产天然防腐剂苯乳酸的工程菌。方法：分析超耐热菌（Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ，Ａ． ａｅｏｌｉｃｕｓ）Ｄ乳酸脱氢酶（ＤＬＤＨ）的三维构象，并与构建的可视化突变体三维模型进行对比，通过 比较酶活性中心氨基酸残基与底物的空间构象，优选最佳模型进行定点突变、克隆、表达和苯乳 酸发酵实验。结果：优选到Ｆ４９Ａ和Ｙ２９７Ｓ两个单突变模型和一个Ｆ４９Ａ／Ｙ２９７Ｓ双突变模型，分 别进行定点突变和工程菌构建，三个突变工程菌均能发酵产生苯乳酸。结论：可视化定点突变乳 酸脱氢酶可作为构建高产苯乳酸工程菌的有效方法。 关键词　可视化　突变　苯乳酸　乳酸脱氢酶 中图分类号　Ｑ８１２ 　　细菌产生的天然防腐剂Ｌ或Ｄ苯乳酸都是由Ｌ或 Ｊｍｏ项目下，在每一个 ＰＤＢ项目下可用 ＪｍｏｌＶｅｒｓｉｏｎ Ｄ乳酸脱氢酶在厌氧时催化苯丙酮酸形成的，虽然乳 １２．０．４１软件在线观察；ＬｉｇａｎｄＥｘｐｌｏｒｅｒ软件，在每一 酸脱氢酶的底物适应性较宽，但它的天然底物是丙酮 个ＰＤＢ项目下的配体浏览器（ＬｉｇａｎｄＥｘｐｌｏｒｅｒ）中下载 酸或乳酸。乳酸菌的乳酸脱氢酶具有苯丙酮酸活性， ＰＤＢｊｎｌｐ文件到本地，打开文件在线 自动用 Ｌｉｇａｎｄ ［１］ 但只有丙酮酸活性的２％～２０％ ，这也是乳酸菌合成 Ｅｘｐｌｏｒｅｒ软件观察。 ［２］ 苯乳酸能力低的原因。Ａｎｔｏｎｙｕｋ等 用Ｘ射线测定了 １．１．２　Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓＤＬＤＨ基因　以ＮＣＢＩ上公布的Ａ． Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓＤＬＤＨ的晶体结构，建立了该酶的三维结构 ａｅｏｌｉｃｕｓＶＦ５，ｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅ，（ＮＣ＿０００９１８．１）序列为 （ＰＤＢ编号：３ＫＢ６）。在对３ＫＢ６的三维结构分析后，发 标准，送恒泽生物经大肠杆菌密码子偏好优化后合成。 现酶活性中心区域的第４９位苯丙氨酸和第２９７位酪氨 基因命名为 ＰＥＳＤＬＤＨ，细胞为Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ＰＥＳＤ α 酸残基的苯环是向催化中心突出的［图２１（ａ）、（ｂ）］， ＬＤＨ。 阻碍了大分子的底物（如苯丙酮酸）与活性中心氨基酸 １．１．３　菌株、细胞和质粒　大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５，Ｅ． α 残基的结合，使酶对底物的催化效率降低。 ｃｏｌｉＢ２１（ＤＥ３）购自鼎国生物有限公司；大肠杆菌表达 质粒ｐＥＴ２１ａ（＋），本室保存。 １　材料与方法 １．１．４　突变引物　根据ＤＬＤＨ基因序列和定点突变 １．１　材　料 的要求设计出两对包含突变位点的引物，其中小写字 ① １．１．１　ＬＤＨ氨基酸序列　源自ＧｅｎＢａｎｋ。分析软 母为突变的碱基 件：蛋白质分子