单抗阻断ELISA检测口蹄疫病毒NSP抗体方法建立.pdfVIP

牛羊传染病 的变性复性过程，才能作为诊断抗原使用，而且背景较高；杆状病毒表达系统非特异性反应较小，但表达 量低，而且成本极高。相比之下，毕赤酵母表达系统具有外源蛋白分泌表达，表达量高、便于商密度发酵 3ABC基因截短体的毕赤酵母表达载体， 以及表达产物生物活性好等优点。本研究成功构建了表达FMDV 证实了该重组蛋白具有良好的免疫学活性和特异性，为进一步研制FMDV鉴别诊断试剂盒奠定了基础。 在本研究虽然实现了3ABC基囚截短体的分泌表达，但表达量不高。究其原因，可能是因为3A基因属于 膜相关蛋白，表达出来的3ABC蛋白阻断了酵母细胞的正常分泌表达机制。类似现象，其他研究者在脊髓 灰质炎病毒3A基因时也曾遇到”J。因此，有必要进一步研究以优化表达条件，提高目的蛋白表达量。 参考文献略 单抗阻断ELISA检测口蹄疫病毒NSP抗体方法建立 王传彬，田新生，王宏伟，孙明，曹振， 遇秀玲，金萍，陈西钊，田克恭 (农业部兽医诊断中心，北京，100094) 摘要 研究检测试剂盒提供基础。方法用亲和层析法纯化抗FMDNSP单克隆抗体，并标以辣根过氧化物酶．再 性群、感染群体和灭活疫苗免疫群体的血清样本，确定了试验体系的临界值。结果纯化斤单抗有良好的 体和灭活疫苗免疫群体，可以检测O、A、C、和亚洲I型血清抗体。并能同时检测牛、羊、猪和豚鼠等动 物血清。结论初步建立了检测牛、羊、猪血清FMVNSP抗体的单抗阻断ELISA方法，可作为避一步研 制试荆盒和进行应用试验的基础。 关键词 口蹄疫病毒，非结构蛋白，单克隆抗体．阻断ELISA 目前国内普遍应用口蹄疫(FMD)灭活疫苗进行疫病防制，如何准确区分疫苗免疫动物和感染动物， NSP抗体，可以区分自然感染动物与灭活疫苗免疫的动物。国外学者先后利用基因]=释方法成功表达了 果最好…Iz】】。国际动物卫生组织(OIE)也将其列为FMD感染的诊断方法之--13I。 但是．用该表达抗原研制的检测方法在我国应用之后．效果不是很理想。其主要原因在于国内所用FMD 灭活疫苗所含的成份比较复杂，携带非结构蛋白的细胞成份含量较高，加之疫苗被人为加大接种剂量以及 多次反复接种，容易使免疫动物产生非结构蛋白抗体，因此，选择合适的抗原，采用高度特异性的单抗介 导反应模式，是FMDV非结构蛋白抗体检测技术成败的关键。 由于FMDV7个血清型存在很大的抗原差异。ELISA试验体系对各型血清的覆盖性，对于今后FMD 监测工作尤为重要。此外，FMDV能感染70多种家茸、实验动物和野生动物，冈此，建立一种能同时检 测不同种属动物的ELISA方法，对于FMD监测也很重要。 我们在前期工作中已经分段克隆表达了FMDV3ABC基因，并利用筛选出的重组抗原免疫小鼠，制各 能同时用于不同种属动物、检测不同型FMDVNSP抗体的单抗阻断ELISA方法。 950 第六次全国会员代表大会暨第11欢学术研讨会 1材料 1．1口蹄疫病毒NSP蛋白 电泳纯度检查为一条带。 1．2FM-DVNSP单克隆抗体腹水 效价：20480。 1．3FlVlD标准血清 豚鼠FMDVO、A、C和亚洲I型标准血清各1份，购自中国农业科学院兰州兽医研究所。 114口蹄疫阴性群体的血清 共计1590份，其中牛血清830份，羊血清356份，猪血清404份。来自美国、澳大利甄、加拿大、 法国、瑞典等无口蹄疫国家的动物，经出入境检疫为口蹄疫阴性，由本单位保存。 1．5口蹄疫病毒人工感染动物的血清 经人工接种口蹄疫病毒并且出现口蹄疫临床症状牛的血清60份，由内蒙生物药品厂和本单位共同制 备。 1．61：2蹄疫病毒自然感染动物血清 共计182份，来自临床发病群体的动物，经PCR检测、病毒分离鉴定为121蹄疫病毒，且血清样本经 集并保存。 L7口蹄疫灭活疫苗免疫群体的血清 共计156份。其中经灭活疫苗反复免疫制备的牛血清27份，由内蒙古生物药品厂和本单位共同制备 并保存；采自口蹄疫灭活疫苗免疫接种的健康牛的血清99份．由中国农业科学院兰卅【兽医研究所提供． 1．8质控血清 由特异性质控血清样本6份和敏感性质控血清样本7份组成。其中包括了阴性、免疫和感染的牛、羊、 猪血清．由本单位制备。 2方法 2．1亲和层析纯化单抗 按文献