玉米象线粒体细胞色素c氧化酶亚基ⅲ基因克隆与表达-中国农业科学.pdfVIP

中国农业科学 2016,49(23):4544-4554 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.23.007 玉米象线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因克隆与表达分析 1 1 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 侯昌亮 ，王靖博 ，李永强 ，吴 华 ，马志卿 ，冯俊涛 ，张 兴 1 2 （西北农林科技大学无公害农药研究服务中心，陕西杨凌 712100 ； 陕西省生物农药工程技术研究中心，陕西杨凌 712100 ） 摘要：【目的】克隆辣根素可能的作用位点——细胞色素 C 氧化酶亚基Ⅲ（COX Ⅲ）的全长 cDNA，并对其进 行序列分析及原核表达。【方法】在 NCBI 数据库中查找玉米象（ Sitophilus zeamais ）COX Ⅲ已知的部分序列， 利用 RT-PCR，结合 RACE 技术克隆获得玉米象 COXⅢ全长序列；利用 DNAMAN8.0、MEGA5.1、GENEDOC、ProtParam 和 TargetP 1.1 Server 等软件对该基因全长 cDNA 序列、系统进化关系、基本理化性质及其三维结构进行分析； 将玉米象 COXⅢ基因分别与载体 pEASY-Blunt E1、pET28a、pET30a、pET32a、pET42a 连接，构建原核表达载体 pEASY-Blunt E1-COXⅢ、pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、pET32a-COXⅢ、pET42a-COXⅢ并分别转化至大肠杆菌 BL21（DE3）中，在不同 IPTG 诱导浓度、温度以及时间内诱导融合蛋白表达，采用 SDS和 Western blot （WB）对表达结果进行验证。【结果】获得的玉米象 COXⅢ基因全长 cDNA 序列开放阅读框（ORF）为 792 bp，编 码 263 个氨基酸，编码的蛋白分子质量约为 30 938.1 Da，理论等电点 pI 6.51，预测分子式为 C H N O S ， 1492 2154 338 362 10 不稳定系数为 34.49，总平均亲水系数为 0.492，为疏水的稳定蛋白。系统发育树显示玉米象与鞘翅目象鼻虫科 昆虫米象进化关系最近。原核表达结果表明，该蛋白在 18℃、1 mmol·L-1 IPTG 诱导 24 h 的条件下即能实现融 合蛋白的表达，可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在；Western blot印迹检测证实大肠杆菌BL21(DE3) 中表达了一个分子量约为 62 kD 的融合蛋白。【结论】成功从玉米象昆虫克隆得到 COXⅢ全长 cDNA 序列，并实 现了其编码蛋白的原核表达，可为后续探究玉米象 COXⅢ功能和异硫氰酸酯类化合物对玉米象的作用机理提供 理论依据。 关键词：玉米象；细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ；RACE技术；生物信息学；原核表达 Cloning and Expression Analysis of Cytochrome C Oxidase Subunit Ⅲ from Sitophilus zeamais 1 1