骨髓基质干细胞和施万细胞联合移植对周围神经缺损修复作用.docVIP

骨髓基质干细胞和施万细胞联合移植对周围神经缺损修复作用 　　[摘要] 目的 探讨骨髓基质干细胞（BMSCs）与施万细胞（SCs）联合移植对周围神经损伤的修复作用。 方法 雌性SD大鼠48只随机分为A、B、C、D 4组，每组各12只；制作右下肢长10 mm坐骨神经缺损模型后，A组注入全贴壁法培养的BMSCs与差速贴壁结合阿糖胞苷法培养的SCs，B组仅注入BMSCs，C组仅注入SCs，D组注入磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照。分别于4、8周观察动物一般状态，测定坐骨神经功能指数（SFI）、神经传导速度（NCV）以及免疫组化检测表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达水平。 结果 4周时，SFI绝对值A组（53.07±5.36）优于B组（62.73±7.63）、C组（67.17±8.06）、D组（77.56±2.79），差异有统计学意义（P 　　1.3 指标的观察与评定 1.3.1 大体观察 观察术后切口情况，右下肢活动能力、步态变化。于4、8周处死动物后观察损伤神经的修复长度及直径。 1.3.2 坐骨神经功能指数（SFI）的测定 每组术后4、8周分别取6只大鼠，记录双下肢足印2～3对，测量损伤侧足印长度（足跟到足尖距离）（EPL）、正常侧足印长度（NPL）、损伤侧足趾宽度（第1趾到第5趾距离）（ETS）、正常侧足趾宽度（NTS）、损伤侧中间足趾距离（第2趾到第4趾距离）（EITS）、正常侧中间足趾距离（NITS）。根据公式SFI=-38.3（EPL-NPL）/NPL+109.5（ETS-NTS）/NTS+13.3（EITS-NITS）/NITS-8.8，计算SFI值，0～-12代表正常功能，-13～-99代表功能部分恢复，-100代表无功能。 1.3.3 神经传导速度（NCV）的测定 4、8周时，每组取SFI测定完毕的大鼠，麻醉后俯卧位固定于操作台上，暴露双侧坐骨神经，游离PLGA导管两侧神经干，应用多导电生理记录仪测定双侧坐骨神经的传导速度，并进行统计学分析。 1.3.4 碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）的免疫组化检测 NCV测定结束后，对各组大鼠处死，取出双侧坐骨神经，去除导管，石蜡包埋后切片脱蜡，3% H2O2浸泡20 min；加入兔抗大鼠bFGF单克隆抗体和兔抗大鼠EGF单克隆抗体（抗体稀释度1∶200），室温过夜；PBS冲洗后，加入生物素二抗（抗体稀释度1∶400），37℃孵育60 min；PBS冲洗后加入新配制DAB显色。各例随机选取6张切片，每张切片随机选取5个高倍视野，应用Image-ProPlus专业图像分析系统测定平均光密度值（AOD），并进行统计学分析。 1.4 统计学方法 采用统计软件SPSS 18.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P 0.05）；D组作为阴性对照，其坐骨神经功能仍有部分恢复。术后8周时A组SFI绝对值优于B、C、D组，差异有统计学意义（P 0.05）。说明细胞移植在损伤4周后仍有修复，而单纯导管修复功能无恢复。见表1、图1。 2.5 神经传导速度测定 各组伤侧NCV均小于正常侧，差异有统计学意义（P 0.05），说明细胞联合移植对恢复神经传导速度的作用更为持久。4周时A组损伤侧NCV大于B、C、D组，差异有统计学意义（P 0.05）；B、C组损伤侧NCV均大于D组，差异有统计学意义（P 0.05）；B、C组损伤侧NCV均大于D组，差异有统计学意义（P 0.05），但均高于D组，差异有统计学意义（P 0.05），但均高于D组，差异有统计学意义（P 　　BMSCs在特定的条件下具有分化为神经干细胞，进而分化为神经细胞的能力。神经干细胞能够分泌多种神经营养因子，减轻损伤所致的炎症反应，维持轴突的稳定性，防止轴索反应的扩大。损伤发生后，损伤远端SCs细胞会发生变性，产生大量的EGF和bFGF等因子，为干细胞的分化提供适宜的微环境[9]，BMSCs植入体内后，会在这种微环境下分化，使营养因子的水平呈现放大反应，加速轴突再生。同时，BMSCs分化的神经元会发出突起，交织成网，介导神经信号的传导。SCs植入体内后，会产生黏层素、Ⅳ型胶原等构成基底膜的主要成分，沿支架内壁形成神经外膜，为轴突再生提供生物支架，弥补体内原有SCs分泌的不足[10]。同时移植的SCs也能够分泌营养因子，加速BMSCs的分化作用[11]。 SFI的结果可以看出，联合移植对大鼠坐骨神经功能的恢复作用更为突出，而单细胞移植则没有差别，说明了BMSCs与SCs的移植修复作用相当，都是为轴