转座子标签技术是利用转座子作探针克隆出突变基因.docVIP

转座子标签技术是利用转座子作探针克隆出突变基因，再用突变基因做探针，从野生型个体中分离并克隆出野生型基因，最终得到完整的基因的技术方法。转座子标签（transposon tagging）技术是研究功能基因的有效的工具之一。转座子标签法不但可以通过上述转座突变分离基因，而且当转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时，还会由于T-DNA整合到染色体中引起插入突变，并进而分离基因，因此大大提高了分离基因的效率。 转座子标签(transposon tagging)技术是研究功能基因的有效的工具之一。转座子标签技术克隆基因的基本原理： 转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得一恢复。遗传分析可确定某基因的突变是否由转座子引起。由转座子引起的突变便可以转座子DNA为探针，从突变株的基因组文库中钓出含该转座子的DNA片段。并获得含有部分突变株DNA序列的克隆，进而以该DNA为探针。筛选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。根据转录因子的作用特点可分为二类；第一类为普遍转录因子它们与RNA聚合酶共同组成转录起始复合物，转录才能在正确的位置开始。TFD以外，还发现TFA，TFF，TFE，TFH等，它们在转录起始复合物组装的不同阶段起作用。第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子，这此TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素，生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。人类型基因的转录因子 因子 分子量 功能 RNAPol ≥10K 依赖模板合成RNA TFA 12, 19, 35K 稳定TFD和DNA的结合，激活TBP亚基 TFB 33K 结合模板链（-10～+10），起始Pol结合，和TFE/F相互作用 TFD (TBP, 30K) TBP亚基识别TATA，将聚合酶组入复合体中，TAFs识别特殊启动子 TFE 34K(β),57K(α) 结合在Pol的前部，使复合体的保护区延伸到下游 TFF 38, 74K 大亚基具解旋酶活性（RAP74）,小亚基和Pol结合，介导其加入复合体 TFH 具激酶活性，可以磷酸化PolC端的CTD，使Pol逸出，延伸 TFI 120K 识别Inr，起始TFF/D结合 TFJ 在TFF后加入复合体，不改变DNA的结合方式 TFS RNA合成延伸 TBP作为第一个和DNA接触的因子十分引人注目，有是它被看成是一种“束缚”因子（commitment factor）其实是和RNA pol 结合，使启动子转录，它起到介导的作用。由于TATA框离转录起始位点的距离是固定的，识别它对RNA聚合酶来说是重要的。TBP在启动上对各种聚合酶所起的一个相同的作用是将它们组入转录复合体中。 TFA含有几个亚基（在酵母中有2个，在哺乳动物中有3个），当它加入复合体中时，TFD所保护的DNA区域就延伸更上游的区域。它可能通过解除TAFs的阻遏作用而激活TBP，它的参与使TFD和TATA框结合得更稳定 TFB分子量为33Kda，它在起始点邻近区域，从-10到+10可以部分地保护模板链在TATA框下游与DNA松散结合。形成复合物，和DNA双链结合是不对称的，它还可以使TFE/ⅡF相互作用。 TFF含有2个亚基，大亚基RAP74，具有ATρ-依赖性DNA解旋酶活性，它和起始时DNA链的熔解有关。它的小亚基是RAP38，和细菌的σ因子有部分同源，紧密地和RNA pol 结合。介导pol和其它蛋白结合转录成复合体。TFF-polⅡ和复合体连接时，与TFB的相互作用是重要的。RNA Pol结合位点在模板链上达到下游+15，在非模板链上达到+20，其长度贯穿了整个复合体 ，上游也被其保护了。TRE结合在pol的前部，使复合体的保护区延伸到下游双链的+30处。 TRH和 TRJ在TRF之后也加入复合体中，但并不改变DNA的结合方式。TFH具有激酶活性，可以磷酸化RNA pol 尾巴上的CTD，CTD的磷酸化使pol从转录因子中释放出来，这样就能离开启动子开始延伸。 表RNApol启动子的转录因子的结构和功能因子?结构?功能　　TFA?38Kda,有9个锌指?结合于1型内部启动子(5sRNA基因)的C框，使C结合在C框下游，辅助B定位结合　　TFB?含TBP和另外二种蛋白?定位因子，使Pol结合在起始位点上　　TFC?含τA和τB，有5个亚基?τA结合A框，起启动子的作用；τB结合型内部启动子(tRNA基因)的B框，起增强子的作用。辅助B定位结合　　TD?含TBP亚基?结合TATA框，确定选择Pol　　PBP?次近端结合蛋白