低氧及低氧训练对AMPKα2转基因小鼠骨骼肌CPT1表达影响.docVIP

低氧及低氧训练对AMPKα2转基因小鼠骨骼肌CPT1表达影响摘 要：目的：研究低氧和低氧训练对AMPKα2转基因小鼠骨骼肌CPT-1的mRNA和蛋白表达水平的影响，进而探讨低氧和低氧训练中AMPKα2调节脂肪酸氧化过程的可能机制。方法：健康两月龄C57BL/6J品系的野生小鼠和AMPKα2转基因小鼠，分别分为常氧安静组、低氧安静组和低氧训练组，共六组，每组10只。低氧组小鼠持续暴露于低氧房中（模拟海拔4000m高度，氧浓度12.3%），其中低氧训练组小鼠还要在此低氧房中进行跑台运动，12m/min，每天1h，持续2周。测定股四头肌 AMPKα2蛋白水平以及CPT-1的mRNA和蛋白表达情况。结果：2周的低氧和低氧训练对AMPKα2的蛋白表达没有显著的影响；低氧和低氧训练均显著提高了CPT-1的mRNA表达（?P? 分为野生常氧安静组（C），野生低氧安静组（H），野生低氧训练组（S），转基因常氧安静组（CT），转基因低氧安静组（HT）和转基因低氧训练组（ST）共六组，每组10只。?1.2 实验方案 常氧安静组小鼠不施加运动负荷，正常笼中活动。低氧组小鼠持续暴露于北京体育大学低氧房中（模拟海拔4 000 m高度，氧浓度12.3%）两周，其中低氧训练组小鼠还要在此低氧房中进行每天1 h跑台速度为12 m/min的跑台运动。最后一次训练结束即刻开始禁食，12h后脱颈处死，取双侧股四头肌，锡纸包裹，迅速投入液氮，再转移至-80℃冰箱保存。 ?1.3 实验仪器和试剂 ?型号为MG96+/Y的PCR扩增仪（杭州朗基科学仪器有限公司），7 500荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司），生物电泳图像分析软件（FR-980 Smart View，复日科技）。? Trizol（Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（Promega公司），SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems公司），发光液（ECL Western Blotting Substrate，Pierce），X光片（Kodak）。抗体：AMPKα2，goat polyclonal IgG；CPT-1，goat polyclonal IgG；β-actin，mouse monoclonal IgG；donkey anti-goat IgG-HRP（Santa Cruz Biotechnology公司）。 ?1.4 指标测试方法 ?1.4.1 RNA和蛋白的提取 ?1.4.1.1 总RNA的提取 取100 mg股四头肌在液氮环境下研磨成粉末状，移入预冷的1 mL Trizol中，颠倒混匀15 s，冰上静置5 min后加0.2 mL氯仿，震荡1 min后再次冰上静置5 min，?12 000 rpm 4℃离心15 min。吸取上清移入另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温下静置10 min，12 000 rpm 4℃离心15 min，弃上清。加入1 mL 75%乙醇（用DEPC水配制），7 500 rpm 4℃离心10 min，弃上清，再次用75%乙醇洗涤，弃上清。在超净台中晾干，去除痕量乙醇，溶于20 μL DEPC水。通过1%琼脂糖凝胶电泳图谱确定RNA的完整性。 ?1.4.1.2 总蛋白的提取 取100 mg股四头肌在液氮环境下研磨成粉末状，移入预冷的1 mL蛋白裂解液（Tris-Cl、NaCl、EDTA、Triton-x-100、PMSF），静置30 min，12 000 rpm 4℃离心30 min，吸取上清。 ?1.4.2 Real-time PCR 采用实时荧光定量（Real-time PCR）两步法。逆转录的具体反应条件是70℃ 5 min，42℃ 1 h，70℃ 15 min，合成的cDNA 于-20℃储存备用。用Primer 5软件设计引物，并经BLAST验证后，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。反应体系为20 μL，包括SYBR Green PCR Master Mix（2×）10 μL，PCR Forward Primer(5μM)1 μL，PCR Reverse Primer(5μM)1 μL，cDNA模板2 μL，ddH?2O 6 μL。实时荧光量数值由实时定量PCR仪（Step One实时荧光定量PCR系统）读取，目的基因表达结果用比较CT法相对定量，目的基因=2-△△CT。? 1.4.3 Western Blot 先用考马斯亮蓝G-250法测定总蛋白量，计算得出蛋白的上样量，用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出目的蛋白（AMPKα2，CPT-1）和内参蛋白（β-actin），再转移至0.45 μ