副干酪乳杆菌6-磷酸山梨醇脱氢酶（gutF）基因的克隆和超表达.pdfVIP

· 52· 中圈奶冲·20108·科·技 副干酪乳杆菌6一磷酸山梨醇脱氢酶( )基因的克隆和超表达 丁寅寅，左芳雷，卢晓明，赵建云，壬欧，陈尚武 (中国农业大学食品科学与营养工程学院教育部北京市功能乳 品重点实验室．北京 100083) 中图分类号：TS252 文献标识码 ：A 文章编号 ：1004—4264(2010)08—0052—04 摘要：为研 究6一磷酸山梨醇脱氢酶基 因在乳酸菌中超表达的影响．本试验根据副干酪乳杆菌的基因序列设计引物 ． 用PCR的方法扩增6一磷酸 山梨醇脱氢酶 (gutF)基 因，将其连接到乳酸菌表达载体 pMG36e，并将重组质粒转化到 副干酪乳杆菌及乳酸乳球菌中获得重组菌株 ；对重组菌株表达产物进行蛋 白质水平的电泳检测 ．检测 出表达了大 约28kD的蛋 白；使用山梨醇替代培养基中的葡萄糖 ，以未转化基因菌株做 阴性对照，进行生长曲线的测定．结果表 明，转化菌株能够利用在 以山梨醇作为碳源的条件下，重组菌株的生长速度和最终菌浓度均优越于对照菌株 本研 究通过超表达6一磷酸山梨醇脱氢酶蛋 白，对于进一步研究乳酸茵的耐受性具有十分重要 的理论基础 关键词：6一磷酸山梨醇脱氢酶 ：超表达 ：山梨醇 6一磷酸山梨醇脱氢酶 (S6PDH，EC1．1．1．200)，广泛 研究乳酸菌 的耐受性 ．以进一步提高其功能具有十分 存在于蔷薇科木本植物与微生物中．是将糖酵解中间产 重要的意义 物 6一磷酸果糖经过酶促反应转变成无毒的山梨醇的关 1 材料与方法 键酶l1】2)。山梨醇是一种糖醇．作为一种小分子渗透物质 ． 1．1 材料 可以改变细胞渗透势 ．从而可以提高生物耐盐 以及抗逆 1．1．1 质粒和菌种 性的能力 3【1 pMD19-Tsimple载体试剂盒 (TaKaRa公司，大连)； 目前研究表明，将 6’磷酸山梨醇脱氢酶转化到百合、 表达载体 pMG36e，本实验室保存 ；副干酪乳杆菌(Lac 苹果、水稻等植物中．对于提高植物的耐盐性_4具有十 tobacillusparacasei)L14，本实验室保存 ；大肠杆菌 ( ． 分重要的意义 由于6一磷酸山梨醇脱氢酶转化果糖成 cherichiacoli)DH5a感受态细胞 (全式金 ，北京)：乳酸 山梨醇是可逆反应 ．会影响淀粉积累、糖和酸性物质之 乳球菌(Lactococcuslactis)LM0230(Sridhar，VR馈赠)。 间的平衡 ．采用基因沉默技术抑制该酶的活性 ．对于果 1．1．2 工具酶及其他试剂 实的风味也会构成一定影响f7J 限制性内切酶、T4DNALigase、ExTaqDNA聚合酶 、 乳酸菌作为益生菌的一种 ．具有诸如缓解乳糖不耐 dNTP、DL2000DNAmarker等 (TaKaRa公司，大连)；琼脂 症 、调节消化道微生态平衡等益生作用 ，其应用领域十 糖凝胶 DNA回收试剂盒 (Biomed公司，北京)：X—Gal、 分广泛 。目前 ．有学者利用乳酸菌基因工程菌株生产 IPTG、氨苄青霉素 、红霉素等药品均为进 口或国产生物 山梨醇I9， 主要就是在缺乏菌株中过表达 6一磷酸山梨 试剂 ：引物合成及序列测定由美国 Invitrogen(上海)英 醇脱氢酶 ．在 以葡萄糖为底物的条件下生产山梨醇 骏生物技术有限公司完成。 本文通过克隆副干酪乳杆菌中6一磷酸山梨醇脱氢 1．2 基 因组提取及 gutF基 因的克 隆 酶 (gutF)基因．实现该基因在乳酸菌 中的超表达 ，对表 副干酪乳杆菌 L-l4基因组的提取根据文献}1】1并进 达产物进行蛋白质表达水平的检测 ．利用山梨醇做底物． 行改进 根据 GeneBank发表的干酪乳杆菌的gutF基 对重组菌株利用山梨醇的能力进行初步检测 ．旨在探讨