表达反义核酶RNA的转基因水稻对矮缩病毒复制和症状的抑制作用.PDFVIP

维普资讯 z77 8 e2ffq) 第11卷第 3期 中 国 病 毒 学 vd 11 No．3 1996年 9月 VIROLOG[CA sINICA SO． 1996 表达反义核酶RNA的转基 因水稻 对矮缩病毒复制和症状的抑制作用 ‘ 杨文定 吴祖建 ．压 苏燕 刘伟平 叶寅 谢联辉 田波 ·■-_ 。。。0 ‘。__。～ (中目科学院麓生协研究所，北京 100~0) lf’o (稿建农业大学植物病毒研究所，福州 350002) 2 t 提要 用基因棺法将古有RDV第五片段反义棱酵序列基因的植物表达载体 pROKI[转化水稻幼 胚，在 G418存在的条件下。约 2～3十 月可筛选出抗性童伤，转^分化培养基 中培养可分化出幼 苗。经 Soathem杂交法拉浏为阳性的水稻幼苗进行抗病性测定显示，转 RDV反义核酵基因的水 稻植株对 RDV的复制和定状有显著抑制作用。转‘基因植株发病鞍轻，并蕾部分结实，面对照植株 剐明显矮化且大多不 良抽穗 关键词 变塑璧星瘟垂，墨墨茎醴E旦：茎苎里查塑-抻制病毒复制 r^／ ． 水稻普通矮缩病是 由黑尾叶蝉 (№坤 fz妇 cincticeps)传播的病毒病害．此病普遍分布于 我国南方地区，能造成水稻严重减产．其病原为水稻矮缩病毒 (ricedwarfvirus．RDv)。RDV 属于植物呼肠孤病毒属 (plantreovLrus)的第一亚属。病毒可在传毒介休 叶蝉休 内复制，并随 叶蝉卵传给后代lI1。RDV属双链 RNA病毒．基因组包含 12条 dsRNA片段。我们针对 RDV s5的核酶攻击位点．将一锤头型核酶引入 SSIII反义链上，柑建成反义核酶基因 SSIIIR。将 S5IIIR插入植物表达载体 pROKII，用基因枪法转化水稻幼胚 ．用G418进行选择培养。从抗 性禽伤中分化出幼苗，转化植株对 RDV 的复制和症状发生有显著抑制作用。 材料和方法 1 材料和试剂 1．1 水稻 转化用承稻 以安徽地方水稻品种 (0b翻 sati~aL)为材料，水稻幼藿采 自中国农业科学院品资 所承稻组同室。病毒鬟殖用水稻品种为台中本地 1号。 12 病 毒 为水稻矮绾病毒按攥分离物。 1．3 试 荆 分子生物学 实验所 用的 cDNA合成试剂盒，4×dNTP及 随机引物 合成试 荆翦 自Boo．hlJl~er Mannheim公司。PCR扩增用的Taq酵 、限制性 内切酵、修饰酵均翦 自Promega公司和华美生物工程公司。 反转录酵 M—MLV—RTase购 自BRL公司，PCR引物 由丰所技术室合成。 2 方法 2．1 未成熟胚培养 将开花后 15d的水稻幼穗 ，iI去颖壳，幼搬种子用 自来水磊洗干净。用 70％乙醇授泡 2 min，后用0．1％升汞灭菌 15~20mhl，再用无菌水磊洗 4童 ，共约20--30rain。在无茁条件下将幼旺弱出。盾 车文于 1995~ 12月 11日收爿 ．1996年 3月4日謦 回 ·863高技术资助项 目 维普资讯 278 中 国 病 毒 学 第 “眷 片朝上放入固体培养基 中(N6基本培养基，2．4一D2mg／L．3％蔗糖，0．7％琼脂 ．pH5．7高压灭菌)．暗处培 养 2～3d备甩 2．2 质垃掏建 利用PCR引入法将具有锤头状棱爵序列引入 $5111反义链 ．将该重组克隆用Xbal和Sacl酶 切后以低熔点琼脂塘凝胶回收．与经 同种内切酶处理的pROKI[载体连接。转化