(生物制药工艺学)第八章离子交换法(ion-exchange.ppt

琼脂糖凝胶离子交换剂 琼脂糖凝胶上引入功能基 DEAE —sepharose CL-6B CM —sepharose CL-6B DEAE—Toyopearl CM—Toyopearl * 多糖基离子交换剂应用——尿激酶分离纯化 * 第九节 离子交换聚焦色谱 色谱聚焦（chromatofocusing）: 是一种高分辨的新型的蛋白质纯化技术。是根据蛋白质的等电点，结合离子交换技术的大容量色谱，能分离几百毫克蛋白质样品，洗脱峰被聚焦效应浓缩，分辨率高。 适用水溶性的两性分子，如蛋白质、酶、多肽、核酸等。 * 一、色谱聚焦的原理 （一）自动形成pH梯度。 （二）蛋白质的色谱行为 （三）聚焦效应 * PH梯度溶液的形成 在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带有缓冲能力的电荷基团，故PH梯度溶液可以自动形成。 * PBE94柱聚焦色谱的pH梯度 * （1）柱内每点的PH值从高到低逐渐下降。 （2）从层析柱顶部到底部就形成了PH6～9的梯度。 （3）PH梯度会逐渐向下迁移。 （4）底部流出液的PH由9逐渐降至6。 蛋白质的色谱行为 当柱中PH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，不与阴离于交换剂结合,随洗脱液向下移动 。 当蛋白质移动至环境PH高于其PI时，蛋白质由带正电荷变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。 由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境PH 再次低于P