地黄生长期根叶中梓醇和总环烯醚萜苷含量变化.doc

地黄生长期根叶中梓醇和总环烯醚萜苷含量变化 　　摘要： 地黄主要活性成分为环烯醚萜苷，其中含量最高的是梓醇。该文主要对地黄生长发育过程中根叶所含总环烯醚萜苷和梓醇的含量变化进行研究。以地黄85-5为材料，于地黄不同生长期进行不同直径块根、不同叶龄的样品采集，分别采用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定总环烯醚萜苷和梓醇的含量。研究结果表明，7―9月同一生长期地黄不同叶龄中总环烯醚萜苷和梓醇含量，幼嫩组织中含量较高，随着叶龄的增加而逐步下降；比较各生长期相同着生部位的叶片中梓醇和总环烯醚萜苷含量，大多数部位的叶片在10月达到最高；同一生长期块根直径越大，有效成分含量越高；梓醇含量同总环烯醚萜苷含量呈正相关。以期通过以上初步结论可以为地黄的萜类代谢调控研究和栽培技术提供参考依据。 关键词： 地黄；生长周期；梓醇；总环烯醚萜苷 [收稿日期] 2013-09-09 [基金项目] 国家自然科学基金项目 [通信作者] 李先恩，研究员，博士，Tel：（010E-mail：xeli@implad.ac.cn [作者简介] 吉雪琪，硕士研究生，E-mail：jixueqi1699@yeah.net 地黄Rehmannia glutinosa Libosh，为玄参科多年生草本植物，是著名的“四大怀药”之一，具有滋阴清热、补血止血等功效[1]。与人参、栝楼、葛根共称为中药治疗消渴病之四大“圣药”[2]。环烯醚萜苷类物质是地黄中的主要活性成分。梓醇是地黄中含量最高的环烯醚萜苷[3]，其多种生物活性已得到实验验证。研究表明，梓醇对脑缺血损伤、老年痴呆、帕金森、糖尿病及其并发症均有一定的治疗和预防作用[4-7]。 有关地黄中总环烯醚萜苷含量变化的研究尚未见报道，梓醇积累规律的研究已有不少报道[8-12]。与前人研究不同的是本研究首次将研究对象细化，测定不同生长时期地黄不同直径块根、不同叶龄中总环烯醚萜苷和梓醇含量，全面探讨地黄有效成分的分布和变化规律，为萜类次生代谢产物积累的研究奠定一定的理论基础。 1 材料 地黄为主栽品种温85-5，于2012年4月16在中国医学科学院药用植物研究所试验田种植。种植土壤类型为壤土，种植密度为 40 cm×40 cm，按常规方法进行田间管理。2012年7月19日，8月13日，9月13日，10月15日采样，共4次。每次随机采集地黄植株25株左右，采集时选择长势基本相同的植株（出芽时标记）。叶片按照叶龄划分，最幼嫩部分标记为叶-1，依次类推为叶-2～叶-8；块根按照直径分为粗、中、细，具体数值见表1。采集样品经液氮速冻后，保存于-80 ℃冰箱。 UV-752紫外-可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司），Waters 600E高效液相色谱仪（2487紫外检测器，2707自动进样器），CBL Model 100型柱温箱（Photoelectyon Technology 公司），Empower2色谱工作站，1/1万天平（上海仪器厂），1/10万天平（METTLER TOLEDO，梅特勒-托利多），超声波清洗机TP300（天鹏电子新技术背景有限公司），电热恒温鼓风干燥机（上海精密实验设备有限公司）。梓醇（批对照品购自天津一方科技有限公司，纯度98%以上；乙腈（色谱纯，Honey Well公司），水为娃哈哈纯净水，2，4-二硝基苯肼（西亚试剂），其他试剂均为分析纯。 2 方法 2.1 含水量测定 精密称取不同叶龄、不同根径样品5 g左右，参照2010年版《中国药典》一部附录Ⅸ H 水分测定法第一法，测定含水量。 2.2 总环烯醚萜苷含量测定 2.2.1 测定方法 采用分光光度法[13]，精确吸取1.0 mL反应液加入1 mol?L-1盐酸溶液2 mL，摇匀，90 ℃水浴反应15 min，室温静置15 min放冷，加二硝基苯肼乙醇溶液0.5 mL，摇匀，90 ℃水浴反应25 min，室温静置15 min放冷，再加入1 mol?L-1 NaOH 70%乙醇溶液3 mL，摇匀终止反应，室温静置1.5 h。以70%乙醇为空白对照，在462 nm处测定吸光度。 2.2.2 对照品溶液的制备及标准曲线 精密称取梓醇对照品5.35 mg以70%乙醇定容至25 mL量瓶，摇匀，制成每1 mL中含241 μg梓醇的对照品溶液。分别精密吸取梓醇对照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL入10 mL量瓶中，加入70%乙醇定容。按照方法2.2.1所述，以70%乙醇反应为空白在462 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，对照品含量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=