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药用真菌猪苓菌核渗出液理化性质探究 　　[摘要] 探讨不同发育阶段人工培养的猪苓菌核渗出液的理化性质。对药用真菌猪苓进行培养，系统地观察不同发育阶段的猪苓菌核及其渗出液的形态特征；对不同发育阶段猪苓菌核渗出液的pH进行测定；采用硫酸-苯酚法测定猪苓菌核渗出液的多糖含量；并利用BCA蛋白含量测定方法测定猪苓菌核渗出液的蛋白含量，利用紫外吸收法测定猪苓菌核渗出液中过氧化氢酶（CAT）的含量。在猪苓菌核发育过程中，菌核渗出液pH出现先升高后降低的趋势；渗出液的多糖含量逐渐下降；渗出液的蛋白含量及CAT含量出现逐渐升高的趋势，说明猪苓菌核渗出液形成过程中伴随着高水平的氧化应激反应。添加维生素C以后，部分地消除了活性氧，因此CAT活力下降。猪苓菌核渗出液的pH在猪苓菌核形成过程中一直维持酸性状态，间接反应出酸性环境有利于猪苓菌核的形成；菌核渗出液具有逐渐产生且最终被菌核重新吸收的特征。 [关键词] 猪苓；菌核；渗出液；多糖；CAT [收稿日期] 2013-07-07 [基金项目] 国家自然科学基金项目；国际科技合作项目 （2011DFA31260） [通信作者] *郭顺星，研究员，博士生导师，研究方向为药用植物菌根生物学，Tel：（010E-mail：sxguo1986@163.com [作者简介] 邢咏梅，博士，助理研究员，研究方向为药用真菌学，Tel： （010E-mail：meimary@163.com 猪苓Polyporus umbellatus （Pers.） Fr.是一种珍贵的药用真菌。猪苓的药用部位是菌核，用于治疗水肿、急性肾炎、尿频尿急、黄疸以及腹泻等疾病[1-4]。然而，随着猪苓药用范围的扩大，加上野生猪苓资源的商业采挖，导致野生猪苓资源濒临枯竭。目前，人工栽培猪苓存在菌核生长缓慢，需要以天然猪苓菌核作为种苓等缺点，严重制约了猪苓的大面积栽培。本实验室在以往的研究中发现，人工培养的猪苓菌核与天然猪苓菌核特征性化学成分的指纹图谱基本一致，具有潜在的应用价值[5]。 然而，许多研究者致力于植物病原菌菌核生理生化特性的研究，而对于药用真菌菌核的研究报道较少。本研究对人工培养的猪苓菌核渗出液的理化性质进行研究，为猪苓菌核形成的生理过程提供重要的理论依据。 1 材料 本实验所用猪苓采自山西古县北平镇党家山村，由中国医学科学院药用植物研究所郭顺星研究员分离鉴定，保存于麦麸琼脂培养基。 麦芽糖，K2HPO4，KH2PO4，MgSO47H2O，维生素B1，除菌滤器，微孔滤膜（孔径0.22 μm，直径13 mm），琼脂粉等购自北京科百奥生物科技有限公司。Novagen BCA Protein Assay Kit购自默克公司，过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。 培养基：麦芽糖20.0 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO47H2O 0.5 g，琼脂粉15.0 g，去离子水1 L。 2 方法 常规高压灭菌后冷却至60 ℃左右，0.05 gL-1维生素B1通过0.22 μm微孔滤膜加入到灭菌后的培养基中，充分混匀后于直径9 cm的培养皿中倒平板，每个平皿倒入20 mL培养基[2，5]。维生素C（Vit C）添加组在分装培养基前，将维生素C通过0.22 μm微孔滤膜加入至培养基中配制成终浓度为0.5 gL-1的溶液后再倒平皿，每个平皿倒入20 mL培养基。 2.1 观察猪苓菌核渗出液形成情况 随着培养时间的延长，观察猪苓菌核的形态特征及渗出液的产生，并在菌核发育的不同阶段收集猪苓菌核渗出液，置-80 ℃备用。 2.2 猪苓菌核渗出液的pH测定 取猪苓菌核发育不同阶段（30，50，70，80 d）的菌核渗出液，以Mettler Toledo pH计测定其pH。每个样本重复3次，该实验重复3次。 2.3 猪苓菌核渗出液多糖含量的测定 精确称取无水葡萄糖（105 ℃干燥至恒重）10 mg置10 mL量瓶，加去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精确吸取上述溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL于具塞试管中，加去离子水1 mL，加6%苯酚溶液1 mL，加浓硫酸5 mL，混匀，置沸水浴中加热15 min，取出后立即置冰水中冷却30 min，在490 nm波长处分别测定吸光度。绘制标准曲线，求出回归方程。精密量取不同培养时间的猪苓菌核渗出液1 mL，以氯仿、丙酮抽提除色素，以石油醚除酯。加入8 mL石油醚，充分混匀，4 500 rmin-1离心10 min后，弃上清，加5 mL去离子水，混匀，超声提取30 mi