细胞分子生物学（扬州大学）第九章 基因文库.pptVIP

第九章基因文库 基本概念 定义：用重组DNA技术将某种生物DNA的随机片段与载体连接，转化细胞（菌）后产生不同的克隆，这种包含某种生物所有基因的克隆群体称为基因文库( DNA library) 分类： 基因组文库(genomic DNA library)：用基因组DNA构建，反映基因组全部信息，用于基因组物理图谱构建、基因组序列分析、染色体上基因定位、基因组中基因结构和组织形式分析等 cDNA文库：用以mRNA为模板在反转录酶作用下形成的互补DNA（cDNA）构建，反映基因组表达的基因序列信息，用于特定细胞中基因表达状态和表达基因的功能研究 第一节基因组文库 一、基因组DNA的提取 提取方法：不同生物基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类不同组织的分离方法也有差异。通常先制备细胞核，然后用蛋白酶消化、酚抽提法去除蛋白质、脂类和其它不需要的大分子 质量要求：高分子量，100-150kb，无脂类、酶、RNA等污染 注意事项：提取过程中应尽量在温和条件下操作,以避免染色体发生机械断裂 二、随机片段的制备 方法： 机械法：如超声波破碎法, 产生的片段末端主要为平端，少数非平端需要补平 酶切法，效率较高，可控性较强，但可因酶切位点的非随机分布和碱基修饰产生非随机片段，常用的限制酶如Sau3A，其识别位点为5-/GATC-3，消化片段能与BamHI酶切载体相匹配 注意事项： 为了获得可克隆的基因组DNA片段，有必要控制限制酶使用量和进行部分消化 在选择限制酶时，必须考虑消化片段的末端类型（粘端还是平端）、能否直接与酶切载体相连以及所选酶是否能被DNA碱基修饰所抑制等 消化时间、酶与DNA的比例一般要通过预试验确定，消化产物需用琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度离心法纯化 三、克隆载体选择与制备 载体选择：大肠杆菌等细菌基因组文库可用质粒载体构建；哺乳动物基因组文库通常用λ噬菌体、粘粒或YAC载体构建，其中EMBL3和λDASH等λ置换型载体是最用的基因组文库构建载体 制备方法：选择与插入片段酶切位点匹配的限制性酶，将载体DNA充分消化后，用密度梯度离心或琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收法纯化，尽量做到1次制备的载体DNA消化片段足够预试验和构建完全文库所用 四、文库产生与质量评价 插入片段与载体DNA连接：应注意连接反应体系中总DNA浓度和两种DNA分子的克分子比，以提高重组频率，通常需要反复的预试验确定 连接产物转化：质粒文库用转化方法进行，效率较低；噬菌体文库用感染法转化，效率较高 质量评价： 重组子的比例越高，文库质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。通常是随机挑取一些重组子，提取质粒DNA或噬菌体DNA，经限制酶切后进行电泳分析，根据有无插入片段及其大小和公式计算文库大小 第二节 cDNA 文库 一、mRNA分离与纯化 二、cDNA合成 第一链cDNA合成： 反应体系：25?l,包括反转录酶、引物、mRNA (2?g)和4种dNTP 引物：全长cDNA常以oligo（dT）引物合成，随机cDNA以随机6核苷酸混合物为引物合成，有时可用基因特异引物 反转录酶：常用的有禽成髓细胞性白血病病毒(AMV)和莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶, 各有优缺点 跟踪分析：反应体系中可加少量放射性标记的dNTP 第二链cDNA合成： 传统方法：自身引导法，即将第一链cDNA变性，降解RNA，以cDNA3-端自身环化形成的发夹结构为引物和DNA聚合酶合成，最后用单链特异性S1核酸酶消化发夹结构，不可避免导致对应mRNA5-端序列丢失，现已被其他方法代替 置换合成法：在焦磷酸钠存在条件下合成第一链cDNA，用RNAaseH降解cDNA/RNA杂交分子上的RNA，产生一系列带3-OH的RNA引物，用大肠杆菌DNA聚合酶+连接酶（避免异常结构产生）合成第二链cDNA，最后用T4 DNA聚合酶使双链cDNA形成平端 三、cDNA末端处理及载体连接 上述合成的cDNA为平端，而平端DNA的连接效率不高, 有必要进行末端修饰，以便以粘端与载体连接 通常的做法是将平端cDNA与含特定酶切位点的连接头连接，然后用相应的限制酶消化，产生粘性末端 cDNA相对较短，可用质粒载体构建cDNA文库，但构建较大cDNA文库和表达cDNA文库常用λ噬菌体载体 通常需用碱性磷酸酶处理酶切后的载体，以减少载体自连和增加重组分子的比例 第三节基因文库筛选 一、基因文库筛选 定义：从基因文库中分离目标克隆的过程叫做基因文库筛选 经典方法：菌落或噬菌斑原位杂交，将菌落或噬菌体空斑中的DNA转移到杂交膜上，通过标记探针与目标序列的互补结合来显示目标克隆的存在 探针制备：可用已克隆的基因片段、人工合成的寡核苷酸、根据蛋白质部分氨基酸序列人工合成的简并寡核苷酸和P