细胞分子生物学（扬州大学）第七章 基因操作.pptVIP

第七章 基因操作 (Gene Manipulation) 第一节概 述 一、基本概念 基因工程（genetic engineering）是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学方法为手段，按照预先设计的蓝图，将不同来源的基因与载体分子进行体外连接，将获得的重组DNA分子导入宿主细胞，以达到改变生物原有的遗传特性、获得新品种或生产新产品等目的 基因工程是生物工程的重要分支，与细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成生物工程 基因工程（genetic engineering)又称基因操作、DNA克隆或重组DNA技术 DNA克隆（cloning）：利用酶学方法，在体外将各种来源的DNA与载体分子连接成具有自我复制能力的重组DNA分子（recombinant DNA），通过转化宿主菌或细胞，用筛选获得的转化子进行同一DNA分子大量扩增的过程。 ＤＮＡ克隆与亚克隆 (subcloning) :从严格意义上讲，前者是首次对未知或目的基因进行克隆鉴定,后者是将已克隆的DNA分子或其片段转移到另一载体,但在日常工作中，这种区分并不严格 克隆载体(vector):基因工程中的克隆载体是指能携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”,其本质为能自主复制的DNA复制子, 常用的有质粒载体和噬菌体载体 基本结构特点： 能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制 具有合适的供外源DNA插入的限制性内切酶位点 具有合适的选择标记基因(如抗生素抗性基因)，便于重组子的筛选 宿主菌(host)：DNA克隆几乎都以大肠杆菌(E.coli)为宿主菌或称受体菌 受体菌条件：安全, 限制酶和重组酶缺陷,处于感受态 E.coli作为受体菌的优点:遗传背景清楚,繁殖快,易于培养,成本低 E.coli作为受体的不足：缺乏转录后和翻译后加工机制,表达产物形成不溶性包涵体,很难表达大量可溶性蛋白 DNA克隆的一般程序 重组DNA技术的应用 目的基因核苷酸序列的测定，并根据获得的核苷酸序列推导出编码蛋白质的氨基酸序列 基因转录启动子及其它调控序列的分离和鉴定 重组蛋白质的表达及其结构与功能的研究 遗传缺陷等疾病突变基因的克隆与鉴定 分子检测方法的建立与应用 重组药用蛋白的大规模生产 遗传性疾病等复杂疾病的基因治疗 按照人们的意愿进行动植物遗传改造和新物种培育 第二节 质粒DNA的制备 一、基本原理 质粒是一种独立于宿主菌染色体外、能进行自主复制的遗传因子，较宿主菌染色体DNA小得多，因此能用理化方法将两者分开，最简单和常用的方法是碱性溶解法 二、重组菌培养 细菌培养:将质粒转化菌在含特定抗生素的液体培养基(如LB)中培养 小量制备:从几毫升细菌培养中提取质粒DNA，主要用于鉴定 中量制备:从数十毫升细菌培养中提取 大量制备:从数升细菌培养中提取 小量培养在摇床上进行,大量培养常在发酵罐中进行 菌体收集:一般用离心法和微过滤法收集,主要目的是浓缩菌体和去除对后继纯化有影响的培养基成分 三、重组菌的碱裂解 菌体重悬:用溶液I(含EDTA的Tris缓冲液,有时加少许溶菌酶促进细胞壁溶解）悬浮离心收集的菌体沉淀 裂解:加入溶液II，其中的SDS(1%)能使细胞膜溶解和蛋白质变性，NaOH(0.2M)能使DNA变性和RNA溶解 中和:用溶液III(含3M醋酸钾)中和,使质粒DNA复性 离心:变性蛋白和染色体DNA因不能复性而沉淀，而小的环形质粒能快速复性原有结构，并留在离心后的上清液中 四、酚抽提去除杂蛋白 碱裂解法制备的质粒DNA仍含菌体蛋白和RNA等杂质，需进一步纯化 酚抽提是初步纯化质粒DNA的经典方法之一，将苯酚或苯酚：氯仿混合物与质粒溶液混合，经过高速离心后，变性蛋白沉淀于两相界面处，上层水相含较纯净的质粒DNA 酚质量和pH值对质粒的回收率影响很大，应给予足够重视 虽然酚抽提法纯化质粒的纯度仍不高，但能满足一般实验需要 苯酚是强腐蚀危险品，对操作人员具有一定危险性，注意防护，废弃物难以处理 目前已有很多商品试剂盒供选用，但价格较昂贵 五、酒精沉淀浓缩 酚抽提往往导致质粒溶液体积增大和浓度偏低 酒精是沉淀和浓缩核酸（DNA和RNA）的常规方法，具体做法是将核酸溶液与2倍体积100%酒精（可加入终浓度为0.3M的醋酸钠促进沉淀）混合，经过一定时间孵育和高速离心后，便可得到沉淀的DNA或RNA 沉淀后的核酸常溶于体积较小的TE缓冲液保存，其中的Tris具有缓冲作用，EDTA能螯合核酸酶活性所需的镁离子，故能防止核酸酶对核酸的降解作用 能代替酒精使用的沉淀剂还有异丙醇等 六、质粒的纯化 氯化铯（CsCl）密度梯度离心是大量制备高质量质粒DNA的传统方法 基本原理:粗提质粒DNA与含溴乙锭CsCl溶液混合，经长时间超速离心后，CsCl形成连续梯