重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的分离纯化工艺建立.pdfVIP

安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2010Aug；45(4) ’567 · ◇技术与方法 ◇ 重组葡激酶一水蛭素融合蛋白的分离纯化工艺建立 张光满 ，秦宜德 ，于爱平 摘要 目的 建立大肠杆菌高密度表达的重组葡激酶 一水 1 材料与方法 蛭素融合蛋白(STH)分离纯化工艺。方法 高密度培养重 组大肠杆菌并诱导表达 STH，离心收集菌体，反复冻融后收 1．1 材料 集上清液经超滤、两步阴离子交换层析，分离纯化STH 目的 1．1．1 菌种 带有温度诱导型pBV220-STH表达 蛋 白。结果 纯化后的STH纯度为 98％以上，纤溶比活性 载体的工程菌 E．coliBI21(DE3)由本室构建并保 2．6×10IU／mg，活性回收率56％。结论 建立了STH的纯 存 。 化工艺，该纯化工艺简便，时程短，重复性好，适合于大规模 1．1．2 试 剂 Streamline—Q和 Source一15Q (GE 生产。 Healthcare)，凝血酶 (Sigma)，牛纤维蛋白原 (中国药 主题词 重组融合蛋白质类／分离和提纯；色谱法，离子交换 品生物制品检定所)，葡激酶标准品(中国药品生物 自由词 重组葡激酶一水蛭素融合蛋白(STH) 制品检定所)，纤溶酶原 (Roche)，乙腈 (FisherSci— 中图分类号 R341；R446．1 entific)，其他试剂均为分析纯。 文献标识码 A 文章编号 1000—1492(2010)04—0567—03 1．1．3 仪器 发酵罐 BIOSTATC型 (B．Braun， Germany)，超滤器 (MilliporeCorp，USA)，纯化仪 溶栓和抗凝药物的联合应用已经成为治疗心脑 AKTAExplorer(GEHealthcare，USA)。 血管血栓性疾病主要方法。为此人们设计 了许多既 1．2 实验方法 具有溶栓活性又具有抗凝活性的融合蛋 白，如SAK— 1．2．1 高密度发酵 工程菌在40L发酵罐中培养 HV1E1] HV1．SAK[] PLATSAK[] SAK．RGD．K2． 、 、 、 17h后，将温度从 30℃升高到42~C开始诱导，诱导 Hirl3 等，但是这些蛋 白都会引起严重的出血，从 3h收集发酵液。 而影响了这些融合蛋 白的应用。重组融合蛋 白 1．2．2 蛋白提取与超滤 发酵液于4℃，5．0×10 STH 是葡激酶 (staphylokinase，SAK)和水蛭素 r／min离心 15min，收集菌体。取菌体 120g，加入 (hirudin，HV)通过凝血酶识别序列连接起来的双功 2：1(v／v)Tris。HC1缓冲液，pH8．0，经反复冻融法 能融合蛋 白，分子量约为23ku，可通过重组大肠杆 破碎细胞，1．0×10r／min4℃ 离心30min后收集 菌的高密度发酵得到高效表达。本实验建立了重组 上清。上清经过截留孔径为0．22 m的滤膜后收 大肠杆菌高密度培养获得的菌体中重组葡激酶一水 集透过液，置于一20~C保存备用。 蛭素融合蛋 白(staphylokinase—hirudinlinkedbyfactor 1．2．3 第 1步阴离子交换层析 所有操作均在 thrombin，STH)的分离纯化工艺，为STH的大规模 4~C环境下进行的。超滤透过液 以8ml／min的流速 制备奠定了基础。 上预先用 20mmol／LpH8．0Tr