青蛙染色体核型分析.docVIP

青蛙骨髓细胞染色体标本的制备及其染色体核型分析 摘要：染色体核型分析是遗传学研究的重要手段，也是物种分类和鉴定的基本依据。利用染色体标本的制备技术制备青蛙骨髓细胞染色体标本，再利用Photoshop软件对其进行核型分析。通过计算染色体的相对长度、臂指数、着丝粒位置等三个重要参数，根据Levan（1964）划分标准，对虎纹蛙的染色体进行类型分类与排序，获得青蛙染色体的核型。结果表明青蛙二倍体染色体数目为2n=26。其中有5对大型染色体，8对小型染色体。核型公式为：2n=26=22m+4sm. 关键词：青蛙骨髓细胞；染色体标本；核型分析；Photoshop软件 引言： 核型（karyotype）是指一个细胞内整套染色体按照一定的顺序排列起来构成的图像，通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成【1】。对染色体核型分析，不仅有助于了解生物的遗传组成、遗传变异规律和发育机制，而且对预测鉴定种间杂交和多倍体育种的结果、了解性别遗传机理以及基因组数、物种起源、进化和种族关系的鉴定都具有重要的参考价值[2]。 Photoshop软件可将显微摄影得到的染色体照片进行剪切和分离，精确测量染色体各臂的长度及染色体全长，进行染色体的配对、排列，建立核型图。Excel软件可依据染色体的各种参数构建青蛙骨髓细胞染色体的数据分析表，便于染色体间的分析比较。 材料、试剂与仪器 材料： 虎纹蛙，雌性（中山大学细胞生物学实验室提供） 试剂： Carnoy固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、0.1%秋水仙素溶液、0.65%生理盐水、1/15mol/l磷酸缓冲液（pH7.4），Giemsa染液 仪器： 离心机、温箱、显微镜、解剖剪、解剖盘、镊子、刀片、烧杯、胶头滴管、注射器、试管架、10ml离心管、量筒、冰冻载玻片、盖玻片、酒精灯等 方法与步骤 秋水仙素处理：在实验前4小时，称得本组青蛙的重量为32.5g，按动物每克体重3μg的剂量，腹腔注入1ml含97.5μg秋水仙素的生理盐水溶液。 取股骨：处死虎纹蛙后，立即取出股骨，用刀剔掉肌肉。 收集骨髓细胞：用刀片切开股骨的两端，用盛有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，直至股骨变白色为止。将收集的骨髓细胞平衡后放入离心机，以1000r/min离心10min。 低渗处理：弃上清液，加入6ml蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，置26℃温箱中低渗20min。 预固定和固定：再加入5滴新配的固定液，立即打匀，并以1000r/min离心10min后，弃上清液。沿管壁慢慢加入6ml固定液，立即用吸管吹打成细胞悬液，室温下固定20min。1000r/min离心10min后弃上清液。重复固定一次。 滴片：用镊子取预冰冻的干净载玻片，迅速滴上2~3滴细胞悬浮液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，并置酒精灯上微微加热干燥。 染色：将晾干的玻片放在洁净的玻板上，用Giemsa染液染色30min后用自来水冲洗，空气进行干燥。 镜检拍照：在显微镜下用低倍镜找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散适度、长度适中的分裂相进行观察，并拍照。 用Photoshop软件对照片中的染色体进行剪切、分离。 用Photoshop测量工具，测量已分离的各染色体长、短臂长度和染色体总长度，并计算出各条染色体的相对长度、着丝粒指数、臂指数等重要参数。 根据测量数据进行染色体的配对并按照染色体的大小进行排序（从大到小排列，短臂朝上，长臂朝下，性染色体列于最后单独排列），最后整成一张完整的染色体核型图。 实验结果 选择背景清晰、染色体分开明显的图片进行分析，但由于本人在滴片实验操作中，滴片高度太低，染色体聚集扭曲，导致视野中观察不到理想染色体，所以以下展示的图片均由本班同学或实验老师提供。 图1显示的染色体之间分离的较开，染色单体基本伸展，实验结果较理想，可计出青蛙染色体数2n=26 图1 虎纹蛙骨髓细胞染色体（由本班同学提供） 图2是由实验老师提供的标准图，显示的染色体分散适度、长度适中，可用于核型分析。 图2虎纹蛙骨髓细胞染色体（由实验老师提供） 结果分析 4.1青蛙染色体核型分析 用Photoshop软件对图2中的染色体进行配对和排序，得到虎纹蛙的核型图： 图3 青蛙染色体核型 4.2青蛙染色体各参数的数据分析 根据青蛙染色体的短臂长度、长臂长度、总长度等重要参数，绘制出数据分析表如下： 表1 青蛙骨髓细胞染色体的数据分析 编号 短臂长度 长臂长度 染色总长 相对长度 臂指数 着丝粒指数 着丝粒位置 1 3.41 3.93 7.30 17.80 1.14 46.63 m 1 2.83 3.20 6.00 14.60 1.14 46.71