血清学实验技术.pptVIP

一、血清学实验技术 传统的血清学试验一般用免疫动物的血清作为抗体的来源,所以习惯将体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应 现代血清学试验已远远超过了经典血清学试验的范畴 血清学反应的一般特点 抗原抗体结合的特异性:是抗原决定簇(表位)与抗体的抗原结合部位之间的互补结合,具有高度的特异性,但有时也会出现交叉反应现象 抗原抗体结合的比例:只有在比例适当时出现最佳的或可见的反应,当比例不当时可抑制可见反应的出现,称为带现象 抗原抗体结合的可逆性:两者不形成稳定的共价结合,结合力与两者之间非共价键的性质、数量和距离有关,形成的抗原抗体复合物在一定条件下可以解离, 离解常数(K)反映抗体与抗原之间的亲和力,高亲和力结合不易解离 抗原抗体反应的阶段性:特异结合迅速(几秒-几分钟),可见反应阶段较长 影响血清学反应的因素 抗体:包括抗体的动物来源、浓度(效价) 、亲和力 抗原:包括理化特性(如可溶性抗原和颗粒性抗原)和抗原决定簇的数目及种类 电解质:无电解质存在不出现可见反应(沉淀或凝集),一般用生理盐水作为抗体和抗原的稀释液,有时需要特殊的电解质,但浓度过高会出现非特异性蛋白沉淀(盐析) 酸碱度:反应一般在pH6-9的范围内进行 温度:一般在37℃或室温下进行,较低温度(如4 ℃ )出现可见反应慢但特异性强,温度过高会使已结合的复合物解离 时间:可见反应的出现需要一定的时间,需有在一定时间内观察结果或终止反应的概念 血清学试验的应用 抗原抗体的定性检测:抗体的定性检测包括特定病原抗体、致敏原抗体、血型抗体、组织相容性抗原的抗体、自身抗体等的检测,动物血清中存在抗特定病原的抗体提示该动物被相应病原感染或相应疫苗免疫； 特定抗原的检测是传染病免疫学诊断和病原微生物鉴定的主要手段 抗原的定位检测:常借助光学和电子显微镜,在细胞和亚细胞水平研究病原微生物及其表达产物与宿主细胞的关系 抗原抗体的定量检测:包括抗原或抗体的效价及其动态变化测定 1.凝集性试验的分类 玻片凝集试验 可用于未知(待测)抗原或抗体的检测 混合后1-3分钟内观察结果,出现凝集颗粒为阳性 主要用于细菌性抗原(如布氏杆菌和鸡白痢的检疫)和细胞性抗原(血清抗原)的检测 快速简便,只用于定性检测 试管凝集试验 间接凝集试验 将可溶性抗原(正向)或抗体(反向)吸附(包被)在颗粒载体上进行的凝集试验 常用的颗粒载体有红血球(间接血凝试验)和乳胶(乳胶凝集试验)等 一般在微量反应板上进行 可用于抗原或抗体的效价测定 协同凝集试验 葡萄球菌A蛋白()是大多数金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质 SPA能与人和动物(猪、犬、兔、猴、豚鼠)IgG的Fc片段非特异结合 与抗体结合的SPA菌体称为致敏菌体,可与抗原(细菌、病毒、毒素等)发生快速凝集,称为协同凝集试验 主要用于传染病的快速诊断,SPA菌体还可用于IgG的纯化 抗球蛋白(Coombs)试验 2.沉淀性试验的分类 环状沉淀试验 在小口径玻璃管内进行 主要用于抗原的定性检测(如诊断炭疽病的Ascoli试验、链球菌的血清型鉴定、血迹鉴定和沉淀素的效价滴定 出现白色沉淀环的抗原最高稀释倍数为该血清的效价 免疫扩散试验 单向单扩散试验 抗原在含阳性血清的凝胶中单方向扩散,形成沉淀线,随着扩散的进行,已形成的沉淀线不断溶解并形成新的沉淀线,导致沉淀线不断前移,最终形成稳定的沉淀线 沉淀线的距离与抗原的量呈正比 主要用于抗原的定量测定 双向单扩散试验 免疫电泳(Ouchterlony Electrophoresis) 对流电泳 是用电泳加速抗原抗体定向扩散的一种试验 大部分抗原带较强的负电荷,克服电渗力向阳极泳动,IgG带弱负电荷不能克服电渗力而向阴极移动 两者相遇时形成沉淀线 主要用于快速诊断 火箭电泳 在含抗血清的琼脂凝胶(pH8.2)中进行 加在阴极孔中的抗原(大部分抗原带较强的负电荷)在电泳力的作用下向阳极泳动,形成浓度梯度,在抗原抗体比例适合处形成沉淀峰,峰的高度与抗原含量呈正比 主要用于抗原的定量分析 3.免疫标记技术 免疫荧光技术 用荧光素标记的抗体进行抗原抗体反应,然后在荧光显微镜下观察结果,进行抗原(如病毒感染细胞)的定性定位研究 分为直接法(标记第一抗体)和间接法(标记第二或抗抗体) 常用的荧光素由异硫氰酸荧光素(FITC) 免疫酶技术(免疫酶组化染色技术和ELISA) 将抗原抗体反应的特异性与酶的催化高效性相结合的一类技术 可用于抗原和抗体的定性、定位或定量研究 主要包括免疫酶组化染色技术和酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 免疫酶组化染色技术 原理与免疫荧光相似,主要在病例切片或培养细胞上进行 常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 分为直接法(标记第一抗